一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备五分时时彩方法

文档序号:10633789
一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备五分时时彩方法
【专利摘要】本发明涉及一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺?透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备五分时时彩方法:PLA?PEG?COOH溶液逐滴加入到LAP溶液中,搅拌,活化,然后滴加到PEI溶液中,得到LAP?PLA?PEG?PEI,然后加入氯金酸和NaBH4,反应得LAP?PLA?PEG?PEI?(Au0)50;将活化的HA溶液滴加到LAP?PLA?PEG?PEI?(Au0)50水溶液中,搅拌,反应,然后加入DOX,搅拌反应即得。本发明成本低,五分时时彩方法简单,条件温和,易于操作,具有良好的应用前景。本发明的纳米材料负载DOX作为纳米药物缓释体系具有良好的药物缓释效果,对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的靶向性和明显的抑制效果。
【专利说明】
-种负载阿霉素的聚乙稀亚胺-透明质酸修饰的裡皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法
技术领域
[0001] 本发明属于载药纳米材料的制备领域,特别设及一种负载阿霉素的聚乙締亚胺- 透明质酸修饰的裡皂石包裹金纳米颗粒的制备五分时时彩方法。
【背景技术】
[0002] 癌症被认为是21世纪人类面临的重大难题之一。在使用化学药物治疗肿瘤的过程 中,抗癌药物存在水溶性差、在病灶部位保留时间短W及不能特异性识别肿瘤细胞等问题 对人体产生强烈的毒副作用,而且无法有效实现药物对肿瘤的杀伤效果。因此,发展一种具 有肿瘤祀向作用的载体材料实现药物的负载、可控释放与祀向治疗是目前纳米医学的研究 执占。 "、、'、、、〇
[0003] 粘±类纳米颗粒,如裡皂石化aponite,LAP),不仅具有良好的生物相容性,还能够 高效负载药物并实现药物的控制释放,在药物输送领域展现了独特的优势(Wu,Y.L.;Guo, R. . ;aii,X.Y. ;et al.J.Mater.Chem.B2014,2,7410-7418.)。尽管运些文献报道的纳米粒 子体系能够有效地应用于癌症的治疗,但都是一种纳米粒子只能适用于癌症治疗,没有设 及癌症的诊断功能。因此,制备一种新型、高效、多功能的纳米医学平台适用成像和化学治 疗的诊疗一体化中的应用。
[0004] 支化聚乙締亚胺(PEI)是一种分子量较大的支链状PEI,内部有疏水的空腔,具有 支化的Ξ维结构,表面具有大量带正电荷的氨基,为其进一步化学修饰提供了条件。PEI与 其它高分子聚合物相比,它具有良好的热稳定性,在空气中低于30(TC并不分解。特别是近 年来发展的高分子修饰纳米材料的兴起,更是赋予其独特理化性质,拓展其应用领域。在纳 米颗粒合成和修饰方面,PEI不仅可W作为稳定剂防止纳米颗粒的聚集,还可W作为还原剂 制备纳米颗粒,而且PEI丰富的氨基数量就使得其包覆的纳米颗粒均可进一步功能化(Shi, X.Y. ;Zhou,B. . ;Zheng,L. ;et al .ACS Appl .Mater. Inte;rfaces2014,6,17190-9.)。因此, PEI是介导合成和修饰多种纳米颗粒优良的载体。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容 性的链状聚合物,将其修饰到PEI表面能够提高材料的水溶性和生物相容性,同时能延长药 物缓释周期W及增加 Au的加载量。透明质酸(HA),是一种具有良好水溶性的高分子聚合物, 是脊椎动物组织和体液的主要成分。此外,HA可W作为一种生物祀向分子,能与肿瘤细胞表 面过度表达的CD44受体分子特异性结合。通过HA与肿瘤细胞表面CD44受体分子的特异性结 合可实现药物缓释体系对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集,实现肿瘤的特异性的祀向治 疗。
[0005] 查阅国内外相关文献或专利,合成负载阿霉素(D0X)的聚乙締亚胺一透明质酸修 饰的裡皂石包裹金纳米颗粒用于肿瘤祀向治疗与CT成像的研究尚未见报道。

【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种负载阿霉素的聚乙締亚胺-透明质酸修饰 的裡皂石包裹金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,本发明成本低,五分时时彩方法简单,条件溫和,易于操作,具有 良好的应用前景。本发明的LAP-PLA-PEG-PEI-(AuD)5〇-HA负载DOX作为纳米药物缓释体系具 有良好的药物缓释效果,对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的祀向性和明显的抑制效 果。
[0007]本发明的一种负载阿霉素的聚乙締亚胺-透明质酸修饰的裡皂石包裹金纳米颗粒 的制备方
[000引法,包括:
[0009] (1)将聚乳酸一聚乙二醇PLA-PEG-C00田容于溶剂中,然后逐滴加入裡皂石LAP的水 溶液,常溫揽拌反应1-化,透析,得到LAP-PLA-PEG-C00H;
[0010] (2)将LAP-PLA-PEG-C00H的水溶液中加入抓C进行活化2-地,然后加入到聚乙締亚 胺PEI水溶液,揽拌2-3d,透析,得到LAP-PLA-PEG-PEI;
[0011] (3)氯金酸HAu(n4 · 4出0溶于水中得到氯金酸水溶液,然后将LAP-PLA-PEG-PEI的 水溶液加入氯金酸水溶液,揽拌15-30min,然后加入棚氨化钢溶液,揽拌反应l-4h,透析,得 到 LAP-PLA-PEG-PEI-(Au°)己0;
[0012] (4)将透明质酸HA溶于水中,加入抓C进行活化2-地后,加入到LAP-PLA-PEG-PEI- (Ai^sq水溶液中,揽拌反应2-3d,离屯、,得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5()-HA;
[OOU] (5)将LAP-PLA-PEG-PEI-(AuD)日日-HA的水溶液加入阿霉素水溶液,揽拌12-24h,离 屯、,洗涂,分散,即得负载阿霉素的聚乙締亚胺-透明质酸修饰的裡皂石包裹金纳米颗粒 LAP-PLA-PEG-PEI-(Au。)日 0-HA/DOX。
[0014] 所述步骤(1)中PLA-PEG-C00H(购买于济南巧罢生物工程有限公司),其中阳G的分 子量为3000-5000,PLA的分子量为3000。
[001引所述步骤(1)中溶剂为体积比为1:1的丙酬和水的混合溶液。
[0016] 步骤(1)中LAP与PLA-PEG的质量比为1:2-4。
[0017] 步骤(1)中LAP与PLA-PEG的质量比为1:3。
[001引所述步骤(1)中透析具体为:采用的膜为纤维素透析膜,截留分子量MWC0为8000- 14000,在憐酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
[0019] 步骤(2)中抓C与LAP-化A-阳G的摩尔比为10-12:1,LAP-PLA-PEG-C00H与阳I的摩 尔比是15-20:1。
[0020] 步骤(2)中EDC与LAP-PLA-PEG的摩尔比为10:1,LAP-PLA-PEG-C00H与阳I的摩尔比 是 20:1。
[0021] 所述步骤(2)中透析具体为:采用的膜为纤维素透析膜,截留分子量MWC0为50000, 在憐酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
[0022] 步骤(3)中HAuCU · 4化0和LAP-化A-PEG-PEI 的摩尔比为50-60:l,NaBH4与 HAuCl4 · 4出0的摩尔比为2-5:1;棚氨化钢溶液的溶剂为冰水。
[0023] HAuCU · 4出0和LAP-PLA-PEG-PEI的摩尔比为50:1。
[0024] 步骤(4)中邸C与HA的摩尔比为10-12:1,LAP与HA的质量比是3-4:1。
[00巧]步骤(4)中邸(:与齡的摩尔比为10:1,1^\口与齡的质量比是3.5:1。
[00%] 步骤(5)中LAP与D0X的质量比2-4:1。
[0027] 步骤(5)中LAP与D0X的质量比3:1。
[0028] 所述步骤(5)中揽拌速度为100-150r/min;离屯、的速率为8000-10000r/min,离屯、 的时间为5min。
[0029] 本发明中使用PEG可W增加该材料的体内循环时间,并增加后续包裹纳米金的量, 达到更加灵敏的CT造影效果。
[0030] 本发明中氯金酸溶液加入后,揽拌20-40min,使氯金酸分子与聚乙締亚胺修饰的 裡皂石混合,利用氯金酸分子与聚乙締亚胺一透明质酸修饰的裡皂石表面氨基的亲和力使 得其进入其内部空腔,再W强还原剂NaBH4快速还原,得到聚乙締亚胺一透明质酸修饰的裡 皂石包裹的金纳米颗粒,很好地防止了金纳米颗粒的聚集。HAuCU · 4此0:化BH4:LAP-PLA- 阳G-PEI摩尔比为50:250:1 (化肌4与HAu(n4 · 4此0的摩尔比>3:1),既保证纳米金的胶体稳 定性,又有效提高纳米金的含量。在加入棚氨化钢之时,应将化肌4溶液迅速滴加到4此14^与 裡皂石络合物溶液中,快速还原得到产物LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇。
[0031] 本发明中透明质酸化A)是一种具有良好水溶性的高分子聚合物,是脊椎动物组织 和体液的主要成分。此外,HA可W作为一种生物祀向分子,能与肿瘤细胞表面过度表达的 CD44受体特异性结合。通过HA与肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合可实现药物缓释体系 对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集,实现肿瘤的特异性的祀向治疗。
[0032] 裡皂石化aponite,LAP)属于粘±类纳米颗粒,具有良好的生物相容性,并且被证 实可W高效负载药物,是一种具有广泛应用前景的药物载体。LAP经过修饰可W得到聚乙締 亚胺一透明质酸修饰的裡皂石纳米颗粒LAP-PLA-PEG-PEI,它继承了 LAP作为药物载体的全 部优良性质,并且便于负载及稳定金纳米颗粒和进一步修饰,得到LAP-化A-PEG-PEI- (ΑιΛ 50。然而,LAP-PLA-PEG-PEI本身没有对肿瘤的主动祀向效果,因此,将祀向分子连接到 LAP-PLA-PEG-PEI表面,得到具有主动祀向效果的多功能裡皂石纳米颗粒用于药物和金纳 米颗粒负载,是改善抗肿瘤药物载体LAP-PLA-PEG-PEI的有效途径。本发明将ΗΑ连接到1^\口- PLA-PEG-PEI - ( AuD ) 50 表面,得到的 LAP-PLA-PEG-PEI - ( AuD ) 50-ΗΑ 不仅可 W 通过透明质酸的 祀向作用被肿瘤细胞主动摄取,同时将材料的表面电荷转变为负电荷,降低材料毒性,提高 材料稳定性,改善药物释放特性。本发明的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇载体用于抗肿瘤药物 负载和检测,可作为理想的祀向纳米载体,实现药物和诊断分子探针的负载与祀向输送。 [00削本发明使用UV-Vis(紫外可见光谱)、TEM(透射电子显微镜)、TGA(热重分析)、Ze化 表面电势测量、FTIR(傅里叶变换红外光谱仪)测试等五分时时彩方法表征本发明制备的聚乙締亚胺一 透明质酸修饰的裡皂石纳米颗粒,同时用CCK8试剂盒、流式细胞术分析和激光共聚焦显微 镜来检验载药的裡皂石纳米颗粒对肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合的毒性与祀向性, 具体测试结果如下:
[0034] (1)表面电势和水合粒径测量
[0035] 修饰前后粒子的粒径W及表面电势均通过动态光散射进行测定,结果如表1所示。 经聚乳酸-聚乙二醇修饰后,裡皂石的表面电势从-33.7mV变到-15.6mV,测试结果表明,裡 皂石表面已经成功修饰了 LAP-PLA-PEG。在表面进一步修饰了 PEI之后,所得到的LAP-PLA- PEG-PEI表面电势变成34.9 ± 0.802mV。在修饰了祀向分子HA之后,表面电势进一步降低到- 18.5 ±0.208mV。因此,通过修饰前后的电势变化也可W证明成功地合成了LAP-化A-PEG- PEI-(Ai^5〇-HA纳米材料。表面修饰后裡皂石的较小且具有较好的分散性,因此,仍是一种 良好的载体材料。
[0036] 表1LAP、LAP-PLA-PEG、LAP-PLA-PEG-PEI、LM-PEG-FA 的水合直径和表面电势
[0037] L0038」(2)热重分化
[0039] 在附图1所示的热重测试结果中,分析图中从200°C到800°C重量损失可知,与LAP 相比,LAP-PLA-PEG-C00H和LAP-PLA-PEG-PEI在升溫过程中分别损失了总质量的7 2.8 %和 78.6 %。运一结果证明PLA-PEG和阳I均已成功修饰在LAP表面。
[0040] (3)紫外-可见光谱测试
[0041] 在附图2所示的紫外-可见光谱测试结果中,本发明中制备得到的功能化裡皂石的 表面等离子体共振(SPR)峰位于523nm,参见说明书附图3。运表明本发明中制备得到了金纳 米颗粒。运一结果也证实FA已被成功修饰到裡皂石表面。在负载D0X之后,材料在480皿附近 均显示出一个明显的吸收峰。根据文献报道,运个吸收峰为D0X的紫外特征吸收峰。因此,表 面修饰的裡皂石纳米颗粒仍然能够负载抗肿瘤药物D0X。通过紫外定量分析,在投料比为 LAP-PLA-PEG-PE I - (Au。)50-HA: D0X = 3:1 的条件下,LAP-PLA-PEG-PE I - (Au。)50-HA 的载药效 率为91%.
[00创 (4)TEM测试结果
[0043] ??Μ测试结果显示了金纳米颗粒的尺寸及尺寸分布,参见说明书附图3。金纳米颗 粒平均直径约4.6nm,尺寸分布较窄,具有良好的单分散性。
[0044] (5)体外释放结果
[0045] 附图4为LAP-PLA-PEG-(AuD)5〇-阳I-HA/D0X的体外累积释放曲线。在48小时中,D0X 在抑=5.0的弱酸性环境中从LAP-PLA-PEG-阳I - ( ΑιΛ 50-HA/DOX中累计释放了 35±1.22%, 比在抑=7.4的中性环境中累计释放量(12.7±0.939%)高。运说明基于裡皂石的载药体系 均具有抑响应性,即在与肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度快,累积释放率高,而在 正常组织的中性环境中释放速度慢,累积释放率低。
[0046] (6)稳定性测试结果
[0047] 稳定性测试结果表明:发明中制备得到的功能化裡皂石包裹的金纳米颗粒在不同 溫度,不同抑中具有良好的稳定性,无沉淀产生,参见说明书附图5。运表明本发明中制备的 材料稳定性好。
[004 引(7)CCK8 实验
[0049] CCKSii试结果表明:本发明中制备得到的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX解化 癌细胞24h后,在一定浓度范围内促进了癌细胞的调亡,且较纯D0X而言,对癌细胞的疗效更 好,起到药物治疗作用,且不含药载体材料不存在药物毒性,参见说明书附图6。
[0050] (8)细胞吞隧实验
[0051 ] 为了证实LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX的祀向作用,选择CD44受体表达的人 源宫颈癌细胞化La细胞作为模型,采用流式细胞术分析细胞吞隧材料后产生的巧光效果。
[0052] 利用流式细胞仪对化La细胞吞隧药物后产生的巧光效果进行了检测。附图7为DOX 浓度为2.5、5、7.5、10和15yg/mL,药物和细胞共培养4小时之后细胞由于吞隧药物产生巧光 的结果。可W看出,经过4小时共培养,HeLa细胞对于LAP-PLA-PEG-PEI-(ΑιΛ5Q-HA/D0X的吞 隧效果显示出强烈的增强,其平均巧光值与阻断组材料平均巧光值高。实验结果证明本发 明报道的LAP-化A-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX可W通过ΗΑ的祀向作用有效提高肿瘤细胞对 D0X的吞隧,从而增强D0X的抗肿瘤活性。
[0053] (9)细胞内分布实验
[0054] 为了更直观的观察药物在细胞内的分布,采用激光扫描共聚焦显微镜考察了细胞 与药物共培养4小时之后细胞内巧光分布情况。附图8为D0X浓度lOppm条件下化La细胞内巧 光分布结果。可W看出本发明报道的LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX可W通过HA的祀向 作用提高肿瘤细胞对D0X的吞隧作用。
[0055] (10)体外X-射线衰减性能
[0056] 体外X-射线衰减性能测试结果表明,负载阿霉素(D0X)的聚乙締亚胺-透明质酸 修饰的裡皂石包裹金纳米颗粒表现出优异的X-射线衰减系数。参见附图9。
[0057] (11)体外材料祀向HeLa细胞的CT成像
[0化引 口'扫描结果表明相同金浓度下1^\口斗1^\斗66斗61-^11*^)50-齡/00乂复合纳米颗粒与 化La细胞共培养后处理的细胞悬浮液的CT信号比阻断材料强,证明负载阿霉素(D0X)的聚 乙締亚胺一透明质酸修饰的裡皂石包裹金纳米颗粒对化La细胞具有特异性祀向作用。参见 附图10。
[0059] (12)体内肿瘤生长抑制研究
[0060] 体内肿瘤生长测量表明,与生理盐水组相比,注射DOX,LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇- HA/D0X+HA blocking,和LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX的实验组中裸鼠肿瘤生长明显 受到抑制,而且祀向组的抑制效果优于阻断组,证明负载阿霉素(D0X)的聚乙締亚胺-透明 质酸修饰的裡皂石包裹金纳米颗粒对化La细胞具有特异性祀向作用。参见附图11。
[0061] (13)免疫组化分析
[0062] 免疫组化分析表明,经过D0X处理后的裸鼠脏器,尽管肝,脾,肾没有显示出明显的 损伤,但是屯、和肺部分出现明显的大面积坏死(完全粉色不含蓝色区域)。运个结果可W证 明D0X在目前的注射剂量与注射频率下,对屯、和肺造成损伤。然而在LAP-化A-PEG-PEI- (Au〇)5〇-HA/DOX+HA blocking和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au〇)5〇-HA/DOX处理的裸鼠屯、和肺中并 没有发现大面积坏死区域,证明本章所研究的LAP-PLA-PEG-PEI - ( AuD ) 50-HA/DOX在相同的 注射剂量与注射频率下,对屯、和肺的损伤比纯D0X明显减小。参见附图12。
[0063] 综合W上实验结果可W认为,本发明的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX可W明 显提高肿瘤细胞对D0X的摄取,减少D0X对正常组织细胞的毒副作用,改善了D0X的抗癌效 果,具有良好的应用前景。
[0064] 本发明药物载体负载D0X得到的LAP-PLA-PEG-(Ai^日日-阳I-HA/D0X纳米药物缓释 体系具有良好的药物缓释效果,对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的祀向性和明显的抑 制效果,用于癌细胞的祀向治疗。本发明的制备过程简单,实验条件为常溫常压,易于操作。 所制备的材料有望用于体内肿瘤CT诊断,具有良好的诊断应用前景。制备得到的负载阿霉 素化0X)的聚乙締亚胺一透明质酸修饰的裡皂石包裹金纳米颗粒具有良好的祀向及药物疗 效,为新型纳米药物的开发打下了良好的基础。
[0065] 有益效果
[0066] (1)本发明的PEI-FI-(PEG-HA)负载D0X得到的载药纳米颗粒具有良好的水溶性和 生物相容性,较好的药物缓释效果与抑响应性释放特性,对高CD44受体表达的肿瘤细胞具 有祀向性和明显的抑制效果,可用于癌细胞的祀向治疗;
[0067] (2)本发明制备五分时时彩方法简单,反应条件溫和,成本低廉,易于操作,具有产业化实施的 前景。
【附图说明】
[0068] 图 1 为LAP,LAP-PLA-PEG-C00H 和LAP-PLA-PEG-PEI 的热重分析图谱;
[0069] 图 2为LAP-化 A-阳G-阳 I - (Au〇) 50-HA 和LAP-PLA-PEG-PEI - (Au〇) 50-HA/DOX的紫外吸 收光谱图;
[0070] 图3为相关材料的TEM照片,其中(a)为LAP,(b)为LAP-化A-PEG-PEI-(Au〇)日0-HA/ D0X(插图为金纳米颗粒的晶格),(c)为(b)的粒径分布图,(d)为(b)的能谱图;
[0071] 图4为在不同抑条件下D0X从LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX中释放的累积释放 曲线;
[0072] 图5为本发明制备的LAP-PLA-PEG-PEI- ( ΑιΛ 50-HA/DOX在(a)不同溫度和(b)不同 抑的UV-Vis谱图;
[0073] 图6为用CCK8法测试得到的HeLa细胞经过LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA、free D0X 和 LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX 处理 2地后的细胞活力;
[0074] 图 7 为流式细胞术测试得到经 LAP-PLA-PEG-PEI-(AuD)5〇-HA/DOX 和 LAP-PLA-PEG- 阳I-(Ai^5〇-HA/DOX+HA blocking处理地后,HeLa对D0X的吞隧情况(纵坐标为细胞内吞D0X 后的平均巧光强度,与吞隧量成正比,*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001);
[0075] 图 8 为HeLa细胞经生理盐水 NS(a)、LAP-化 A-PEG-PEI-(Au〇)日 o-HA/DOX+HA 61〇〇1^叫(6)和1^\口斗1^\斗66斗61-^1/^)5〇-齡/00乂((3)处理地后细胞内巧光分布,其中材料 中D0X浓度均为lOyg/mL,细胞核用DAPI染成蓝色;其中标尺均为20皿;
[0076] 图9为本发明制备的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX的X-射线衰减系数比较; (a)为CT成像图片,(b)为测得的X-射线衰减强度结果;
[0077] 图10为本发明制备的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX与阻断材料的细胞CT成像 效果和CT值的比较;(a)为CT成像图片,(b)为测得的X-射线衰减强度结果;
[0078] 图11化La移植瘤体积变化图,对实验组裸鼠在第0,7和14天进行瘤内注射,注射 剂量为4mg DOX/kg,相对肿瘤体积根据初始肿瘤大小归一化,(n = 5);
[00巧]图 12经过NS(a)、D0X(b)、LAP-化A-阳G-PEI-(Au°)50-HA/DOX+HA blocking(c)和 LAP-PLA-阳G-阳I-(Ai^5〇-HA/DOX(d)不同治疗的裸鼠的屯、肝脾肺肾五大主要脏器的H&E染 色组织切片照片,照片由相差显微镜拍摄,图中比例尺为100WI1;
[0080] 图13为本发明制备原理示意图。
【具体实施方式】
[0081] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改,运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0082] 实施例1
[0083] (1)在50mL PLA-PEG-C00H的丙酬与水的混合溶液(6mg/mL)中,缓慢滴加入lOmL LAP的水溶液(lOmg/mL),揽拌反应1小时。反应结束后,将得到的溶液全部转移到截留分析 量大小为8000-14000的透析袋中。将透析袋放入装有化去离子水的烧杯中透析,透析持续 2-4天,每天换水3-4次。透析结束后,将透析袋内产品转移到lOOmL玻璃瓶内4°C保存,即得 到聚乙二醇修饰的LAP-PLA-PEG-C00H。
[0084] (2)取上述30mL LAP-化A-PEG-C00H的水溶液(3mg/mL),加入2mL EDC的水溶液 (8.42mg/mU,揽拌反应3小时。然后逐滴滴加到10.98mL阳I的水的溶液(Img/mU,快速揽 拌反应3天。反应结束后,将得到的溶液全部转移到截留分析量大小为50000的透析袋中。将 透析袋放入装有化去离子水的烧杯中透析,透析持续2-4天,每天换水3-4次。透析结束后, 将透析袋内产品转移到1 OOmL玻璃瓶内4 °C保存,即得到聚乙二醇修饰的LAP-PLA-PEG-PEI。
[0085] (3)取上述30血LAP-PLA-PEG-PEI的水溶液(2mg/血),边揽拌边逐滴滴加11祉L氯 金酸溶液(30mg/血),揽拌30min后,加入1.624mg的化肌4溶液化2〇: C曲細(体积比)=2:1), 溶液瞬间变成深红色,在室溫下揽拌反应祉,得到LAP-PLA-PEG-PEI- ( ΑιΛ 50。取2mL的透明 质酸水溶液(3. Img/mL),然后逐滴加入24化L EDC的水溶液(8.42mg/ml),揽拌反应3小时 后,逐滴加入到上述LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5g溶液中,快速揽拌反应3天。反应结束后,将溶 液分别转移到15mL离屯、管中,在转速为SOOOrpm条件下离屯、(5min),得到的沉淀用去离子水 洗涂3次后溶于lOmL的水中,加入7.23mL浓度为Img/mL的D0X水溶液,在避光的条件下磁力 揽拌反应24小时,反应结束后,将溶液分别转移到15mL离屯、管中,在转速为SOOOrpm条件下 离屯、(5min),得到的沉淀用去离子水洗涂3次,即可得到载药纳米颗粒LAP-^A-PEG-PEI- (Au°)5〇-HA/DOX。
[00化]实施例2
[0087] W紫外可见吸收光谱图对材料的稳定性进行分析,取0.5mg/mL实施例1制备的功 能化的树状大分子材料,溶剂为蒸馈水,置于4°C,37°C,50°C的溫度条件下和抑=5,6,7,8 的条件下,测其紫外可见吸收光谱。
[0088] 实施例3
[0089] 取实施例1所得产品W蒸馈水为溶剂,配制金浓度为0.04M的母液。之后梯度稀释 出0.02、0.01、0.005、0.0025和0.005M的样品。同时,W临床用舰海醇为对照材料,W蒸馈水 稀释出相应舰浓度的样品。之后,对运两组材料进行CT成像测试。
[0090] 实施例4
[0091] 取培养好的化La细胞种于6孔板中,按照200万细胞/孔的密度接种,每孔体积2mL。 培养过夜后,加入上述两种各稀释梯度的样品,与细胞共培养地。每个梯度用培养液稀释10 倍,即每孔终浓度分别为10、20、40、80、150μΜ。WPBS缓冲液作为空白对照,在实验对比组中 加入化L ΗΑ溶液(WA] =500μΜ)。膜酶消化离屯、后收集细胞,并将细胞均匀的分散在20化 LPBS缓冲液中。之后,对运两组材料进行CT成像测试。
[0092] 实施例5
[0093] 将实施例1制备的1^\?斗1^\斗66斗61-^11〇)5()-齡/0(放分别用抑=7.0和抑=5.4的 缓冲液溶解成浓度为Img/mL的溶液,取ImL放入透析袋中固定,置于含有9mL不同抑的缓冲 液的容器中,放在37°C摇床中振荡。在0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,36,48小时时间点取样。每 次取透析袋外液体ImL,测量其480nm处吸光度值,再向透析袋外加入对应的缓冲溶液ImL。 用此五分时时彩方法得到体外不同抑条件下D0X从LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX中释放的释放曲 线。
[0094] 实施例6
[00巧]配制D0X浓度分别为 12.5、25.0、50.0、75.0、100 . Oyg/mL的纯D0X、LAP-PLA-PEG- PEI-(Ai^5q-HA 和 LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5q-HA/D0X 的无菌生理盐水(NS)溶液(材料加入培 养液中,其浓度要稀释10倍),紫外照射过夜杀菌。收集对数生长期化La细胞,按照1.0 X 104cel 1 s/孔接种在96孔细胞培养板上,置于5 % C〇2,37 °C条件下培养24小时。弃掉培养液 后,每孔更换180化培养液,并加20化含不同D0X浓度的LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX、 纯D0X或LAP-PLA-PEG-阳Ι-(ΑιΛ5〇-ΗΑ的NS溶液或纯NS(对照组),每组设5个平行样。将细胞 培养板继续放置在5 % C〇2,37 °C条件下培养24小时。然后按20化/孔加入CCK8溶液,避光条 件下37Γ恒溫静止培养3小时,然后用酶标仪测量在45化m处紫外吸收值,并根据此值计算 细胞的存活率。
[0096] 实施例7
[0097] 配制D0X浓度分别为25、50、75、80.0、100.0、150 . Oyg/mL的LAP-化A-PEG-PEI- (AuD ) 5G-HA/D0X无菌NS溶液,及500μΜ的高浓度HA溶液。紫外照射过夜杀菌,收集对数期HeLa 细胞,按照2.0 X 105celIs/孔接种在12孔细胞培养板上,置于5%C〇2,37°C条件下培养24小 时。弃掉培养液后,每孔更换90化L培养液,并添加10化L含不同D0X浓度的LAP-化A-PEG- PEI-(Ai^5q-HA/D0X或纯D0X的NS溶液或NS(对照组),在实验对比组中加入扣L HA溶液 ([HA] = 500μΜ)。继续置于5 % C〇2,37 °C条件下培养4小时。倒去培养液,用PBS洗涂3次,加入 100化膜酶消化约3分钟后,立即加入ImL左右PBS吹打并收集细胞,转移到lOmL离屯、管中 10(K)rpm离屯、5分钟,继续用ImL PBS重悬。W巧光分辨率作为参数,将滤网过滤重悬的细胞 液作为样品加入到流式细胞仪中进行检测,得到细胞对药物的吞隧结果。
[009引实施例8
[0099] 将大小合适的处理过的圆形盖玻片W每孔1片的密度放入12孔板中,每孔加入 1 . OmL培养液浸泡过夜。弃掉浸泡培养液后,收集对数生长期HeLa细胞,按照4.0 X 104cells/孔接种在圆形载玻片上,置于5%C02,37°C条件下培养24小时。弃掉培养液后,每 孔更换900化培养液,并添加100化含LAP-PLA-PEG-阳I-( ΑιΛ 5Q-HA/D0X的NS溶液或NS (对照 组),在实验对比组中加入扣LHA( WA] = 500μΜ)溶液。继续置于5 % C〇2,37 °C条件下培养4小 时。弃掉培养液,用无菌PBS洗1-2遍,每孔加2.5%戊二醒的?85溶液80化,静置于4°(:条件下 固定30分钟。弃掉戊二醒溶液,用无菌PBS洗1-2遍,加 DAPI (lug/ml),覆盖细胞即可,静置于 37°C染色15分钟。将DAPI液吸出,用无菌PBS洗3遍,在载玻片上滴加一滴巧光封闭剂,将盖 玻片从12孔板中勾出,将有细胞的一面压到载玻片上,用激光扫描共焦显微镜观察细胞形 态及细胞内巧光分布。
[0100] 实施例9
[0101] 取实施例1所得产品W蒸馈水为溶剂,配制金浓度为20mM的母液。之后梯度稀释出 20、10、5、2.5和ImM的样品,然后用CT成像仪测定复合纳米颗粒的X射线衰减特性,并测量各 个图片的CT信号值。扫描参数为:X射线管电压ΙΟΟΚν,Χ射线管电流80mA,层厚0.625mm。
[0102] 实施例10
[0103] 取实施例1所得产品WPBS缓冲液为溶剂,用无菌PBS缓冲液配制成1500μΜ的母液。 之后梯度稀释为1〇〇、200、400、80化1的样品溶液。另^同样方案并且添加透明质酸阻断分 子作为对照材料。取培养好的化La细胞种于6孔板中,按照200万细胞/孔的密度接种,每孔 体积2mL。培养过夜后,加入上述两种各稀释梯度的样品,与细胞共培养地。每个梯度用培养 液稀释10倍,即每孔终浓度分别为10、20、40、80、150nM。WNS缓冲液作为空白对照。膜酶消 化离屯、后收集细胞,并将细胞均匀的分散在20化LNS缓冲液中。之后,对运两组材料进行CT 成像测试。
[0104] 实施例11
[0105] 取老鼠的肿瘤体积达到100-300mm3的时候开始实验(大约在注射肿瘤细胞四周 后),并将实验开始的时间记为第0天。在第0天,将100化含有D0X,LAP-化A-PEG-PEI- (ΑιΛ 50-HA/DOX,或者LAP-PLA-PEG-阳I - ( ΑιΛ 50-HA/DOX的生理盐水溶液化0X的最终浓度为 Img/mL)通过瘤内注射到各组裸鼠体内。同时,未治疗组的裸鼠注射1(Κ)化生理盐水(安慰 剂),并W此作为空白对照。在第7天和第14天分别重复注射。实验过程中,每Ξ天用游标卡 尺测量肿瘤大小,并记录裸鼠体重。同时,长期观察W记录每组裸鼠的存活时间。肿瘤体积, 相对肿瘤体积,W及相对体重可W用下面的公式(1)-(3)分别计算
[0106] 肿瘤体积(V)=aXb2 (1)
[0107] a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值
[0108] 相对肿瘤体积= V/V〇 (2)
[0109] Vo为肿瘤在开始治疗时的体积大小
[0110] 相对体重=M/Mo (3)
[0111] Mo为裸鼠在开始治疗时的体重
[0112] 实施例12
[0113] 为了确定材料的生物安全性,采用H&E染色法对裸鼠主要组织器官进行免疫组化 分析。实验用裸鼠分为4组,分别经过生理盐水,D0X,LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX+HA blocking和LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5q-HA/D0X处理,其处理五分时时彩方法同例11所述。在第21天,杀 死实验鼠并将主要脏器(屯、,肝,脾,肺,肾和肿瘤)取出,浸泡在10%中性福尔马林溶液中保 存。将获取的脏器包埋于石蜡中,切割为厚度约化m的切片,并按照标准步骤,用苏木精和伊 红染色。用Leica DM IL L抓相差显微镜观察裸鼠的主要组织器官切片,分析经过不同治疗 的裸鼠的器官坏死情况。
【主权项】
1. 一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒的制备方 法,包括: (1) 将聚乳酸一聚乙二醇PLA-PEG-⑶0H溶于溶剂中,然后逐滴加入锂皂石LAP的水溶 液,常温搅拌反应l_2h,透析,得到LAP-PLA-PEG-COOH; (2) 将LAP-PLA-PEG-⑶0H的水溶液中加入EDC进行活化2-4h,然后加入到聚乙烯亚胺 PEI水溶液,搅拌2-3d,透析,得到LAP-PLA-PEG-PEI; (3) 氯金酸HAuCl4 · 4H20溶于水中得到氯金酸水溶液,然后将LAP-PLA-PEG-PEI的水溶 液加入氯金酸水溶液,搅拌15-30min,然后加入硼氢化钠溶液,搅拌反应l-4h,透析,得到 LAP-PLA-PEG-PEI-(Au°) 5〇; (4) 将透明质酸HA溶于水中,加入EDC进行活化2-4h后,加入到LAP-PLA-PEG-TOI-(Auq)5Q水溶液中,搅拌反应2-3d,离心,得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au q)5Q-HA; (5) 将LAP-PLA-PEG-PEI - ( Auq ) 5Q-HA的水溶液加入阿霉素水溶液,搅拌12-24h,离心,洗 涤,分散,即得负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹金纳米颗粒1^41^-PEG-PEI - (AuQ) 5Q-HA/DOX。2. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:所述步骤(1)中溶剂为体积比为1:1的丙酮和水的混 合溶液。3. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:步骤(1)中LAP与PLA-PEG的质量比为1:2-4。4. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:所述步骤(1)中透析具体为:采用的膜为纤维素透析 膜,截留分子量MWCO为8000-14000,在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。5. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:步骤(2)中EDC与LAP-PLA-PEG的摩尔比为10-12 :1, LAP-PLA-PEG-COOH 与PE I 的摩尔比是 15-20:1。6. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:所述步骤(2)中透析具体为:采用的膜为纤维素透析 膜,截留分子量MWC0为50000,在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。7. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:步骤(3)中HAuCl4 · 4H20和LAP-PLA-PEG-PEI的摩尔比 为50-60:1,NaBH4与HAuCl4 · 4H20的摩尔比为2-5:1;硼氢化钠溶液的溶剂为冰水。8. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:步骤⑷中EDC与HA的摩尔比为10-12:1,LAP与HA的质 量比是3-4:1。9. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:步骤(5)中LAP与D0X的质量比2-4:1。10. 根据权利要求1所述的一种负载阿霉素的聚乙烯亚胺-透明质酸修饰的锂皂石包裹 金纳米颗粒的制备五分时时彩方法,其特征在于:所述步骤(5)中搅拌速度为100-150r/min;离心的速 率为8000-10000r/min,离心的时间为5min。
【文档编号】A61K49/04GK105999283SQ201610292982
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】郭睿, 庄英, 史向阳
【申请人】东华大学
再多了解一些
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