包含邻近氨基酸端的志贺毒素A亚基效应子区和细胞靶向性免疫球蛋白型结合区的蛋白的制作五分时时彩方法

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包含邻近氨基酸端的志贺毒素A亚基效应子区和细胞靶向性免疫球蛋白型结合区的蛋白的制造五分时时彩方法与工艺

本发明涉及蛋白质,其包含用于介导细胞靶向的免疫球蛋白型结合区和志贺毒素效应子区,它们组合在一起,使得所述志贺毒素效应子区邻近细胞毒性蛋白的氨基端。本发明的蛋白具有例如用于选择性杀伤特定细胞类型、将外源物质递送到靶细胞内部、标记靶细胞的亚细胞区室和作为治疗分子用于治疗多种疾病、病症和病患(包括癌症、肿瘤、免疫病症和微生物感染)的应用。

背景

从毒素研发有效用作治疗剂的合成的融合蛋白几十年来挑战着科学家(Pastan I,等,Annu Rev Med 58:221-37(2007))。一个障碍是来源于细菌和植物毒素的合成的细胞毒性蛋白的酶促毒性结构部分必须达到其细胞溶胶内的靶标底物才能杀伤细胞。对于多种重组细胞毒性蛋白,细胞毒性的功效取决于细胞内按路线发送的分子效率(Pirie C等,J Biol Chem 286:4165-72(2011));然而,对毒素怎样指导其自身从内体到细胞溶胶的细胞内转运的理解仍是科学探究的挑战(Antignani A,Fitzgerald D,Toxins 5:1486-502(2013))。

多种蛋白包含称为结构域的保守的多肽序列,其形成蛋白结构自我包含的折叠单位,所述折叠单位能够独立于完整蛋白或在重组成直向同源蛋白时行使功能(Kirshner M,Gerhart J,Proc Natl Acad Sci USA 95:8420-7(1988))。在产生新型蛋白时,使用模块式蛋白结构域提供几乎无限的可能性(Nixon A等,Proc Natl Acad Sci USA.94:1069-73(1997))。一种可能性是由靶向性结构域和蛋白毒素结构域构成的嵌合分子的分子改造。已经将天然存在的毒素或截短的毒素片段通过化学缀合或重组蛋白工程技术连接或融合到免疫球蛋白结构域或受体配体上,以希望产生细胞靶向性治疗剂分子(Moolten F,Cooperband S,Science 169:68-70(1970);Thorpe P等,Nature 271:752-5(1978);Krolick K等,Proc Natl Acad Sci USA 77:5419-23(1980);Krolick K等,Cancer Immunol Immunother 12:39-41(1981);Blythman H等,Nature 290:145-46(1981);Chaudhary V等,Nature 339:394-7(1989);Strom T等,Semin Immunol 2:467-79(1990);Pastan I等,Annu Rev Biochem 61:331-54(1992);Foss F等,Curr Top Microbiol Immunol 234:63-81(1998))。所述分子改造的一个目的是设计具有下述双重功能的嵌合分子:1)在系统性施用后,将毒素递送至生物体内的特定细胞类型或位置;和2)利用在真核细胞中有效的强细胞毒性机制实现针对特定细胞的靶向细胞毒性。

志贺毒素家族相关的蛋白毒素,即,从痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)和大肠杆菌(E.coli)分离的毒素,由多种天然存在的结构和功能相关的毒素构成(Johannes L,W,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。例如,志贺毒素家族包括从痢疾志贺氏菌血清型1分离的真正志贺毒素(Stx)、从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素1变体(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)以及从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx仅有一个残基不同,并且二者被称为维罗细胞毒素(Verocytotoxins)或维罗毒素(Verotoxins)(VTs)(O’Brien A等,Curr Top Microbiol Immunol 180:65-94(1992))。志贺毒素家族的成员共有相同的整体结构和作用机制(Engedal N等,Microbial Biotech 4:32-46(2011))。例如,Stx、SLT-1和SLT-2在不含细胞的系统中表现出不可区分的酶活性(Head S等,J Biol Chem 266:3617-21(1991);Tesh V等,Infect Immun 61:3392-402(1993);Brigotti M等,Toxicon 35:1431-1437(1997))。志贺毒素家族成员包含优先结合某些宿主细胞表面上存在的特定的鞘糖脂的靶向性结构域和在进入细胞内部后能够使核糖体永久失活的酶结构域(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。

在感染宿主过程中,志贺毒素家族的成员被细菌用作毒力因子(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。在被感染的宿主中,由于毒素有效的抑制蛋白合成和促进凋亡细胞死亡的能力,志贺毒素是细胞毒性的(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。志贺毒素对宿主细胞的有效的细胞毒性作用可以导致出血性大肠炎和溶血性尿毒性综合征(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。

志贺毒素家族的成员共有以志贺蛋白亚基的A(B)5排列为特征的相同的、多中心的蛋白结构(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。每种志贺毒素由两种蛋白亚基A和B组成,其以A(B)5排列结合形成全毒素蛋白复合物。志贺毒素A亚基是32KD的包含酶结构域的单体,志贺毒素B亚基是7.7KD的亚基,其与另外四个志贺毒素B亚基结合形成志贺毒素B亚基的五聚体。B亚基的五聚体与一个A亚基结合形成志贺全毒素,其约为70KD(O’Brien A,Holmes,R,Microbiol Rev 51:206-20(1987))。

志贺毒素家族的成员共有使宿主细胞中毒的相同的过程,其可以分成五个主要的阶段:细胞表面结合,胞吞,倒退的亚细胞运动到内质网,从内质网移位到细胞溶胶,和在细胞溶胶中酶失活核糖体。第一,通过B亚基特异性结合外质膜小叶上存在的鞘糖脂球形三脂酰基鞘鞍醇Gb3(也称为CD77)的能力而将志贺全毒素引导至特定宿主细胞的细胞表面(Ling,H等,Biochemistry 37:1777-88(1998);Thorpe C等,Infect Immun 67:5985-93(1999);Soltyk A等,J Biol Chem 277:5351-59(2002))。第二,志贺全毒素利用宿主细胞的内吞机制进入到该宿主细胞中,在其中,该全毒素开始被包含在内体中(Sandvig K等,J Cell Biol 108:1331-43(1989);Sandvig K等,Histochem Cell Biol 117:131-141(2002))。第三,志贺全毒素利用宿主细胞的细胞内转运机制到达内质网并且获得进入细胞溶胶的通路(Nichols B等,J Cell Biol 153:529-41(2001);Lauvrak S等,J Cell Sci 117:2321-31(2004);Saint-Pol A等,Dev.Cell 6:525-38(2004))。第四,志贺全毒素的酶活性片段从内质网的腔逆移位到细胞溶胶中(Yu M,Haslam D,Infect Immun 73:2524-32(2005);LaPointe P等,J Biol Chem 280:23310-18(2005);Falguieres T,Johannes L,Biol Cell 98:125-34(2006);Tam P,Lingwood C,Microbiology 153:2700-10(2007))。第五,志贺毒素酶活性片段的细胞溶胶级分通过使宿主细胞的核糖体失活而引起细胞毒性(Tam,Microbiology 153:2700-10(2007))。

在志贺毒素中毒过程中,志贺毒素A亚基在保守的精氨酸残基和甲硫氨酸残基之间(例如,在StxA和SLT-1A中的Arg251-Met252)被弗林蛋白酶(宿主细胞的内切蛋白酶)蛋白水解切割(等,JBiol Chem 270:10817-21(1995))。弗林蛋白酶切割的志贺毒素A亚基的氨基端片段称为志贺毒素“A1片段”(或Stxn-A1,SLTn-A1,SLT-nA1)。志贺毒素A1片段是包含志贺毒素的催化结构域的28KD的蛋白(Fraser M等,Nat Struct Biol 1:59-64(1994))。志贺毒素针对宿主细胞的细胞毒性机制主要是通过A1片段对真核核糖体有效的催化灭活和对蛋白合成的细胞范围的抑制作用(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。

志贺毒素A1片段通过其对真核核糖体的28S核糖体RNA的α-sarcin-蓖麻毒蛋白环中位置4,324的通用保守腺嘌呤核碱基的有效的去嘌呤活性而抑制蛋白翻译(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。在阈值数量的核糖体被失活后,预测宿主细胞经历充分的蛋白合成减少,从而通过凋亡诱导细胞死亡(Iordanov M等,Mol Cell Biol 17:3373-81(1997);Smith W等,Infect Immun 71:1497-504(2003);Lee S等,Cell Microbiol 10:770-80(2008);Tesh V,Future Microbiol 5:431-53(2010))。

使核糖体失活的A-B毒素可以以约1,500个核糖体/分钟的速度在同一个细胞内一个接一个地永久破坏核糖体(Endo Y,Tsurugi K,Eur J Biochem 171:45-50(1988);Endo Y等,J Biol Chem 263:8735-9(1988))。据报道,A-B毒素的功效是极高的,以致少至一个毒素分子就能够杀死细胞(Yamaizumi M等,Cell 15:245-50(1978);Antignani,毒素5:1486-502(2013))。相信单个A-B毒素分子可以在35分钟内不可逆地使300个核糖体失活,并且足以杀死癌细胞(Weldon J,Pastan I,FEBS Journal 278:4683-700(2011))。对志贺毒素A亚基进一步预测该水平的细胞毒性功效,对其已经表明移位到细胞溶胶内的一个分子将足以杀死细胞(Tam,Microbiology 153:2700-10(2007))。

预测志贺毒素家族的全毒素对于作为治疗剂的非靶向应用毒性太高(Jain,R,Tumor physiology and antibody delivery,Front Radiat Ther Oncol 24:32-46(1990))。然而,志贺毒素家族的成员具有通过合理的改变毒素结构、特征和生物学活性而被合成改造用于治疗应用的潜力(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010);Engedal,Microbiαl Biotech 4:32-46(2011))。志贺全毒素具有由两个非共价连接的模块部分构成的二分结构(bipartite structure):包含酶活性A1片段的A结构部分和包含针对细胞表面靶标Gb3的结合位点的B结构部分。由于志贺毒素亚基是模块式的,已经假定可以基于A和B结构部分的分开的结构和功能产生治疗组合物(美国申请20090156417A1;Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010);Engedal,Microbial Biotech 4:32-46(2011);E.P.application 2402367 A1;U.S.application 20130196928 A1,其通过引用完全结合在本文中)。

志贺毒素家族成员的A结构部分是稳定的、酶活性的和细胞毒性的,其独立于任何B结构部分(Engedal,Microbial Biotech 4:32-46(2011))。志贺毒素1A亚基即使在截短或融合到其他蛋白结构域上时也是催化活性的,能够在体外酶失活核糖体,并且是细胞毒性的(Haddad J等,J Bacteriol 175:4970-8(1993);Al-Jaufy A等,Infect Immun 62:956-60(1994);Al-Jaufy A等,Infect Immun 63:3073-8(1995);LaPointe P等,J Biol Chem 280:23310-18(2005);Di R等,Toxicon 57:535-39(2011))。志贺样毒素1A亚基截短在细胞内表达时是催化活性的,能够在体外酶促失活核糖体,并且是细胞毒性的(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。

将毒素连接到靶向性结构域以制得选择性杀死癌细胞的嵌合分子的想法不是新的(Strebhardt K,Ullrich A,Nat Rev Cancer 8:473-80(2008))。例如,自20试剂70年代以来,已经使用下述三种主要的毒素候选物研发了免疫毒素:细菌白喉毒素,细菌假单胞菌(Pseudomonas)外毒素和以蓖麻毒蛋白示例的植物毒素(Antignani,Toxins 5:1486-502(2013))。然而,至2013年,这三种毒素仍然是“免疫毒素研发的首要选择(Antignani,Toxins 5:1486-502(2013))。迄今为止,还没有人描述能够特异性和选择性杀伤被靶向的细胞型的包含与细胞靶向性免疫球蛋白型结合区组合的来源于志贺毒素的氨基酸序列的细胞毒性蛋白。

志贺毒素构建体的细胞毒素功效取决于其到达细胞溶胶的有效性(Tam,Microbiology 153:2700-10(2007));然而,目前对毒素按路线运送到细胞溶胶的分子机制的了解仍然是科学探究的挑战(Antignani,Toxins 5:1486-502(2013))。具有包含志贺毒素亚基A来源的区域的细胞靶向性细胞毒性蛋白是合乎需要的,所述志贺毒素亚基A来源的区域自我指导其自身的细胞内按路线发送,并且展现有效的细胞毒性,用于涉及特定细胞型的靶向性杀伤的应用和用作治疗多种疾病的治疗剂,所述疾病诸如例如癌症、肿瘤、免疫病症和微生物感染。因此,在本领域中,仍然需要改造细胞毒性蛋白的方式,所述细胞毒性蛋白包含在被连接到用于细胞靶向的异源多肽结合区后保留效应子功能(诸如自我指导的细胞内按路线发送和细胞毒性)的志贺毒素亚基A来源的区域。

发明概述

本发明提供多种包含下述的蛋白:1)免疫球蛋白型结合区,诸如来自免疫球蛋白的免疫球蛋白型结合区,和2)志贺毒素效应子区,诸如来自SLT1A的志贺毒素效应子区。免疫球蛋白型结合区与志贺毒素亚基A来源的多肽区的连接能够允许改造志贺毒素细胞毒性的细胞型特异性靶向,并且当组合这两个区域使得所述免疫球蛋白型结合区相对于志贺毒素区不邻近蛋白的氨基端时,细胞毒性最高。本发明的蛋白具有下述应用,例如,用于靶向性细胞杀伤,递送外源物质,作为诊断剂,和作为治疗多种疾病、病症和病患(包括癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染)的治疗剂分子。

本发明的蛋白包含:(a)免疫球蛋白型结合区,其包含一个或多个多肽并且能够特异性结合至少一种细胞外靶标生物分子,和(b)志贺毒素效应子区,其包含来源于志贺毒素家族至少一个成员的A亚基的氨基酸序列的多肽;其中所述免疫球蛋白型结合区和所述志贺毒素效应子区在细胞毒性蛋白内物理排列或定向,使得所述免疫球蛋白型结合区不邻近所述志贺毒素效应子区的氨基端。

本发明的蛋白包含:(a)免疫球蛋白型结合区,其包含一个或多个多肽并且能够特异性结合至少一种细胞外靶标生物分子,和(b)志贺毒素效应子区,其包含来源于志贺毒素家族至少一个成员的A亚基的氨基酸序列的多肽;其中所述免疫球蛋白型结合区和所述志贺毒素效应子区在细胞毒性蛋白内物理排列或定向,使得所述免疫球蛋白型结合区相对于所述志贺毒素效应子区不邻近蛋白的氨基端。

在某些其他实施方案中,本发明的蛋白包含:(a)免疫球蛋白型结合区,其包含一个或多个多肽并且能够特异性结合至少一种细胞外靶标生物分子,和(b)志贺毒素效应子区,其包含来源于志贺毒素家族至少一个成员的A亚基的氨基酸序列的多肽;其中所述免疫球蛋白型结合区和所述志贺毒素效应子区在细胞毒性蛋白内物理排列或定向,使得所述志贺毒素效应子区邻近蛋白的氨基端。

对于本发明的蛋白的某些实施方案,所述免疫球蛋白型结合区包含选自由下述组成的组的多肽:免疫球蛋白型结合区(sdAb)片段,纳米抗体,从骆驼科动物(camelid)来源的重链抗体结构域(VHH片段),从软骨鱼(cartilaginous fish)来源的重链抗体结构域,免疫球蛋白新抗原受体(IgNARs),VNAR片段,单链可变片段(scFv),抗体可变片段(Fv),互补决定区3(CDR3)片段,受限的FR3-CDR3-FR4(FR3-CDR3-FR4)多肽,Fd片段,小模块免疫药物(SMIP)结构域,抗原结合片段(Fab),纤维连接蛋白-来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)(例如单抗体(monobody)),生腱蛋白III型结构域(例如TNfn3),锚蛋白重复基序结构域(ARD),低密度脂蛋白受体来源的A-结构域(LDLR的A结构域或LDLR-A),脂质运载蛋白(anticalins),Kunitz结构域,蛋白-A-来源的Z结构域,γ-B结晶-来源的结构域,泛蛋白-来源的结构域,Sac7d-来源的多肽(affitins),Fyn-来源的SH2结构域,小蛋白(miniprotein),C-型凝集素-样结构域支架,经工程改造的抗体模拟物,以及任何前述物质的保留结合功能性的任何遗传操作的对应物。

对于某些实施方案,当将本发明的蛋白施用给与所述蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞时,所述蛋白能够引起该细胞的死亡。在某些其他实施方案中,当将本发明的蛋白施用给相对于细胞外靶标生物分子的存在或水平不同的两种不同的细胞类型群体时,所述蛋白能够以比针对没有与所述蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型的CD50至少三倍或更小的CD50引起与所述细胞毒性蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞死亡。对于某些实施方案,当将本发明的蛋白施用给其成员与所述蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时,相对于所述第二细胞群体的成员,细胞靶向性分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用至少3倍高。对于某些实施方案,当将本发明的蛋白施用给其成员与显著量的所述蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的第一细胞群体和其成员不与显著量的结合区的任何细胞外靶标生物分子物理连接的第二细胞群体时,相对于所述第二细胞群体的成员,细胞靶向性分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用至少3倍高。对于某些实施方案,当将本发明的蛋白施用给第一靶标生物分子阳性细胞群体和其成员不在细胞表面上表达显著量的所述蛋白结合区的靶标生物分子的第二细胞群体时,相对于所述第二细胞群体的成员,细胞靶向性分子针对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性作用至少3倍高。

在某些实施方案中,设计或选择所述免疫球蛋白型结合区与细胞外靶标生物分子结合的能力,所述细胞外靶标生物分子选自由下述组成的组:CD20,CD22,CD40,CD74,CD79,CD25,CD30,HER2/neu/ErbB2,EGFR,EpCAM,EphB2,前列腺特异性的膜抗原,Cripto,CDCP1,内皮糖蛋白,成纤维细胞活化的蛋白,Lewis-Y,CD19,CD21,CS1/SLAMF7,CD33,CD52,CD133,EpCAM,CEA,gpA33,粘蛋白,TAG-72,酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1),碳酸酐酶IX,叶酸结合蛋白,神经节苷脂GD2,神经节苷脂GD3,神经节苷脂GM2,神经节苷脂Lewis-Y2,VEGFR,αVβ3,α5β1,ErbB1/EGFR,Erb3,c-MET,IGF1R,EphA3,TRAIL-R1,TRAIL-R2,RANK,FAP,生腱蛋白,CD64,间皮素(mesothelin),BRCA1,MART-1/MelanA,gp100,酪氨酸酶,TRP-1,TRP-2,MAGE-1,MAGE-3,GAGE-1/2,BAGE,RAGE,NY-ESO-1,CDK-4,β-联蛋白,MUM-1,胱天蛋白酶-8,KIAA0205,HPVE6,SART-1,PRAME,癌胚抗原,前列腺特异性抗原,前列腺干细胞抗原,人天冬氨酰基(天冬酰胺酰基)β-羟化酶,EphA2,HER3/ErbB-3,MUC1,MART-1/MelanA,gp100,酪氨酸酶相关的抗原,HPV-E7,EB病毒(Epstein-Barr virus)抗原,Bcr-Abl,甲胎蛋白抗原,17-A1,膀胱肿瘤抗原,CD38,CD15,CD23,CD53,CD88,CD129,CD183,CD191,CD193,CD244,CD294,CD305;C3AR,FceRIa,半乳凝集素-9,mrp-14,程序性死亡-配体1(PD-L1),siglec-8,siglec-10,CD49d,CD13,CD44,CD54,CD63,CD69,CD123,CD193,TLR4,FceRIa,IgE,CD107a,CD203c,CD14,CD15,CD33,CD64,CD68,CD80,CD86,CD105,CD115,F4/80,ILT-3,半乳凝集素-3,CD11a-c,GITRL,I类MHC分子(任选地与肽复合),II类MHC分子(任选地与肽复合),CD284-TLR4,CD107-Mac3,CD195-CCR5,HLA-DR,CD16/32,CD282-TLR2,CD11c,CD123,以及前述任一种的任意免疫原性片段。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含来源于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸75-251的志贺毒素效应子区。在某些其他实施方案中,本发明的蛋白包含来源于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸1-241的志贺毒素效应子区。在某些其他实施方案中,所述志贺毒素效应子区来源于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸1-251。在某些其他实施方案中,所述志贺毒素效应子区来源于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸1-261。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含羧基端内质网保留/回收信号基序(carboxy-terminal endoplasmic reticulum retention/retrieval signal motif)。在某些其他实施方案中,本发明的蛋白保安选自由下述组成的组的羧基端内质网保留/回收信号基序:KDEL,HDEF,HDEL,RDEF,RDEL,WDEL,YDEL,HEEF,HEEL,KEEL,REEL,KAEL,KCEL,KFEL,KGEL,KHEL,KLEL,KNEL,KQEL,KREL,KSEL,KVEL,KWEL,KYEL,KEDL,KIEL,DKEL,FDEL,KDEF,KKEL,HADL,HAEL,HIEL,HNEL,HTEL,KTEL,HVEL,NDEL,QDEL,REDL,RNEL,RTDL,RTEL,SDEL,TDEL,SKEL,STEL,和EDEL。

在某些其他实施方案中,本发明的蛋白包含含有SEQ ID NOs:4-19中任一种的氨基酸269-508或基本上由SEQ ID NOs:4-19中任一种的氨基酸269-508组成的结合区。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含SEQ ID NOs:4-31中任一项所示的多肽或基本上由SEQ ID NOs:4-31中任一项所示的多肽组成。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含这样的志贺毒素效应子区,相对于志贺毒素家族成员的天然存在的A亚基,其包含改变志贺毒素效应子区的酶活性的突变。在某些其他实施方案中,所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换,其降低或消除所述志贺毒素区的细胞毒性。在某些其他实施方案中,所述蛋白包含降低或消除催化活性但是保留其他志贺毒素效应子功能(诸如例如,促进细胞内化和/或指导细胞内按路线发送)的突变。在某些实施方案中,所述突变选自至少一个氨基酸残基置换,诸如,例如,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的A231E,R75A,Y77S,Y114S,E167D,R170A,R176K和/或W203A。

本发明还提供包含本发明的蛋白和至少一种药用赋形剂或载体的药物组合物;和所述蛋白或包含其的组合物在本文进一步所述的本发明的五分时时彩方法中的应用。在本发明的某些实施方案中,是包含任意本发明的蛋白和至少一种药用赋形剂或载体的药物组合物。

在本发明的某些实施方案中,是包含本发明的蛋白的诊断组合物,其还包含用于收集信息(诸如诊断上有用的关于细胞类型、组织、器官、疾病、病症、状况和/或患者的信息)的检测促进剂。

除了本发明的蛋白和组合物以外,能够编码本发明的蛋白的多核苷酸也在本发明范围内,以及包含本发明的多核苷酸的表达载体和包含本发明的表达载体的宿主细胞。包含表达载体的宿主细胞可以用在例如通过重组表达生产本发明的蛋白或其多肽组分或片段的五分时时彩方法中。

本发明还包括给蛋白赋予改善的细胞毒性的系统,所述蛋白包含:(a)免疫球蛋白型结合区,其包含一个或多个多肽并且能够特异性结合至少一种胞外靶标生物分子,和(b)志贺毒素效应子区,其包含来源于志贺毒素家族至少一个成员的A亚基的氨基酸序列的多肽;所述系统包括在所述蛋白内使所述免疫球蛋白型结合区邻近所述志贺毒素效应子区的羧基端排列的步骤。本发明还包括用于给蛋白赋予改善的细胞毒性的系统,所述蛋白包含:(a)免疫球蛋白型结合区,其包含一个或多个多肽并且能够特异性结合至少一种胞外靶标生物分子,和(b)志贺毒素效应子区,其包含来源于志贺毒素家族至少一个成员的A亚基的氨基酸序列的多肽;所述系统包括相对于所述志贺毒素效应子区将所述免疫球蛋白型结合区邻近蛋白的羧基端排列的步骤。本发明还包括用于给蛋白赋予改善的细胞毒性的系统,所述蛋白包含:(a)免疫球蛋白型结合区,其包含一个或多个多肽并且能够特异性结合至少一种胞外靶标生物分子,和(b)志贺毒素效应子区,其包含来源于志贺毒素家族至少一个成员的A亚基的氨基酸序列的多肽;所述系统包括将所述志贺毒素效应子区邻近蛋白的氨基端排列的步骤。

另外,本发明提供杀伤细胞的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括使细胞与本发明的蛋白或包含本发明的蛋白的药物组合物接触的步骤。在某些实施方案中,所述接触细胞的步骤在体外发生。在某些其他实施方案中,接触细胞的步骤在体内发生。在细胞杀伤五分时时彩方法的其他实施方案中,当接触关于蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子的细胞外存在和/或表达水平不同的细胞混合物时,所述五分时时彩方法能够比其他细胞和/或细胞型优先选择性杀伤细胞和/或细胞型。

本发明还提供治疗患者中的疾病、病症和/或病患的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括下述步骤:给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的蛋白或药物组合物。在某些实施方案中,使用本发明的五分时时彩方法治疗的疾病、病症或病患选自:癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染。在这些五分时时彩方法的某些实施方案中,要治疗的癌症选自由下述组成的组:骨癌、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症、胃肠癌、生殖细胞癌、腺癌、头颈癌、血液学癌症、肾-尿道癌、肝癌、肺/胸膜癌、前列腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。在这些五分时时彩方法的某些实施方案中,要治疗的免疫病症是与选自由以下组成的组的疾病有关的免疫病症:淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、哮喘、克罗恩病(Crohn’s disease)、糖尿病、移植排斥(graft reiection)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性尿毒性综合征(hemolytic uremic syndrome)、HIV-相关的疾病、红斑狼疮(lupus erythematosus)、多发性硬化(multiple sclerosis)、结节性多发性动脉炎(polyarteritis nodosa)、多关节炎(polyarthritis)、银屑病(psoriasis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、脓毒性休克(septic shock)、舍格伦综合征(Siorgren’s syndrome)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)和血管炎(vasculitis)。

本发明的任意组合物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常和/或免疫病症的应用在本发明的范围之内。在本发明的某些实施方案中是本发明的蛋白和/或其药物组合物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和/或微生物感染。在本发明的某些实施方案中是本发明的蛋白和/或其药物组合物在制备用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症或微生物感染的药物中的应用。

本发明的蛋白的某些实施方案可以用于将另外的外源物质递送进与本发明的蛋白的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞中。另外,本发明提供了一种用于将外源物质递送至细胞内部的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括使体外或体内细胞与本发明的蛋白、药物组合物和/或诊断组合物接触。本发明还提供了一种用于将外源物质递送至患者中的细胞内部的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括下述步骤:给所述患者施用本发明的蛋白(具有或不具有细胞毒性活性),其中所述靶细胞与所述蛋白的细胞外靶标生物分子物理连接。

本发明的任意组合物用于诊断、预后和/或表征疾病、病症和/或病患的应用在本发明的范围内。在本发明的某些实施方案中是使用包含检测促进剂的本发明的蛋白和/或本发明的组合物(例如,诊断组合物)收集疾病、病症或病患的诊断、预后或表征有用的信息的五分时时彩方法。在本发明的某些实施方案中是使用本发明的蛋白和/或诊断组合物检测细胞的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括下述步骤:使细胞与蛋白和/或诊断组合物接触,并且检测所述细胞靶向性分子和/或诊断组合物的存在。在某些实施方案中,所述接触细胞的步骤在体外发生。在某些实施方案中,接触细胞的步骤在体内发生。在某些实施方案中,所述检测细胞的步骤发生在体外。在某些实施方案中,所述检测细胞的步骤发生在体内。在某些其他实施方案中,所述五分时时彩方法包括在将所述蛋白施用给生物体后使用一种或多种成像五分时时彩方法检测所述蛋白在所述生物体中的位置。例如,掺和了本文所述的检测促进剂的本发明的蛋白可以用于表征潜在可用本发明的药物组合物治疗的疾病。例如,本发明的某些化合物(例如蛋白)、本发明的组合物(例如,药物组合物和诊断组合物)和本发明的五分时时彩方法可以用于确定患者是否属于响应本发明的药物组合物的组。

在本发明的某些实施方案中是试剂盒,其包括本发明的物质的组合物,以及任选地,使用说明书,另外的试剂,和/或药物递送装置。

参考以下描述、所附权利要求和附图,会更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点。本发明的前述要素可以单个地组合或自由地除去以便形成本发明的其它实施方案,在下文中没有反对这样的组合或除去的任何陈述。

附图简要说明

图1显示本发明的蛋白的一般排列,“N”和“C”分别表示蛋白或包含志贺毒素效应子区的蛋白的多肽组分的氨基端和羧基端。

图2图示与相反方向的αCD38scFv::SLT-1A相比展现改善的细胞毒性的SLT-1A::αCD38scFv。细胞的存活性百分数相对于细胞毒性蛋白浓度的基于10的对数绘图。

图3图示与相反方向的蛋白αHER2scFv::SLT-1A相比,蛋白SLT-1A::αHER2scFv改善的靶细胞型特异性细胞毒性。细胞的存活性百分数相对于细胞毒性蛋白浓度的基于10的对数绘图。

图4显示αHER2scFv::SLT-1A和SLT-1A::αtHER2scFv的亚细胞定位的显微镜图片。该图片显示两种细胞毒性蛋白在施用一小时内进入靶细胞。

详述

在下文中使用示例性的、非限制性的实施方案和参照附图更充分地描述本发明。但是,本发明可以以许多不同的形式实施,并且不应被理解为限于下面阐述的实施方案。相反,提供这些实施方案使得本公开内容更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人员。

为了可以更容易地理解本发明,在下面定义某些术语。在发明详述内可以发现另外的定义。

如在说明书和所附权利要求书中使用的,除非上下文另外清楚地指明,术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。

如在说明书和所附权利要求书中使用的,当提及两种物质A和B时,术语“和/或”是指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求书中使用的,当提及超过两种物质诸如A、B和C时,术语“和/或”是指A、B、或C中的至少一种,或A、B、或C的任何组合中的至少一种(每种物质以单个或多个可能性存在)。

贯穿本说明书,词语“包含”或变体诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组,但是不排除任何其它整数(或组分)或整数(或组分)的组。

贯穿本说明书,术语“包括”用于指“包括、但不限于”。“包括”和“包括、但不限于”互换使用。

术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对结合到蛋白、多肽或肽中的氨基酸的提及。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”表示在物理上构成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白”是包含一个或多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是尺寸小于总计15-20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”表示在物理上构成肽或多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基,取决于长度。除非另有说明,本文中公开的多肽和蛋白序列从左至右书写,代表它们从氨基端至羧基端的次序。

术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或“多肽序列”包括天然存在的氨基酸(包括L和D异构体(isosteriomers)),且除非另有限制,也包括可以以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的天然氨基酸的已知类似物,诸如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、羟脯氨酸羟丁赖氨酸(hydroxyprolinehypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。用如下表A中的简写名称描述在本文中提及的氨基酸:

表A.氨基酸命名法

关于多肽的短语“保守置换”表示多肽的氨基酸组成的变化,所述变化不会实质上改变整体多肽的功能和结构(参见Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,New York(第2版,1992))。

本文中使用的术语“表达”(“expressed,”“expressing,”或“expresses,”)及其语法变体表示多核苷酸或核酸翻译成多肽或蛋白。表达的多肽或蛋白可以保留在细胞内,变成细胞表面膜的组分,或者被分泌进细胞外空间中。

用于本文时,在至少一个细胞表面表达显著量的细胞外靶标生物分子的细胞是“靶标阳性细胞”或“靶标+细胞”,并且是与指定的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞。

本文中使用的符号“α”是能够与该符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区的简写。符号“α”用于表示免疫球蛋白型结合区的功能特性,这基于它与该符号后的生物分子结合的能力。

符号“::”是指在它前面和后面的多肽区域物理地连接在一起以形成连续多肽。

关于细胞毒性蛋白的细胞毒性活性的术语“选择性的细胞毒性”是指在被靶向的细胞群体和未被靶向的旁观(bystander)细胞群体之间细胞毒性的相对水平,其可以表示为针对被靶向的细胞型的半最大细胞毒性浓度(CD50)与针对未被靶向的细胞型的CD50的比率,以显示对被靶向的细胞型的细胞杀伤的优先性。

就本发明的目的而言,术语“效应子”是指提供生物活性,诸如细胞毒性、生物信号传导、酶促催化、亚细胞按路线发送(subcellular routing)、和/或导致一种或多种因子的募集的分子间结合、和/或变构效应。

就本发明的目的而言,短语“来源于”是指,所述多肽区域包含最初在蛋白中发现的氨基酸序列,且其现在可能包含由原始序列的添加、缺失、截短或其它改变,使得总功能和结构是基本上保守的。

就本发明的目的而言,志贺毒素效应子功能是由来源于志贺毒素A亚基的多肽区赋予的生物活性。志贺毒素效应子功能的非限制性实例包括细胞内化、亚细胞按路线发送、催化活性和细胞毒性。志贺毒素催化活性包括,例如,核糖体失活、蛋白合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸:腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性和DNA酶活性。RIPs可以使核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和polyA)和病毒核酸去嘌呤化(depurinate)(Barbieri L等,Biochem J 286:1-4(1992);Barbieri L等,Nature 372:624(1994);Ling J等,FEBS Lett 345:143-6(1994);Barbieri L等,Biochem J 319:507-13(1996);Roncuzzi L,Gasperi-Campani A,FEBS Lett 392:16-20(1996);Stirpe F等,FEBS Lett 382:309-12(1996);Barbieri L等,Nucleic Acids Res 25:518-22(1997);Wang P,Tumer N,Nucleic Acids Res 27:1900-5(1999);Barbieri L等,Biochim Biophys Acta 1480:258-66(2000);Barbieri L等,J Biochem 128:883-9(2000);Bagga S等,J Biol Chem 278:4813-20(2003);Picard D等,J Biol Chem 280:20069-75(2005))。一些RIPs表现出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性(Erice A等,Antimicrob Agents Chemother 37:835-8(1993);Au T等,FEBS Lett 471:169-72(2000);Parikh B,Tumer N,Mini Rev Med Chem 4:523-43(2004);Sharma N等,Plant Physiol 134:171-81(2004))。已经在体外和在体内观察到志贺毒素催化活性。用于志贺毒素效应子活性的测定可以测量多种活性,诸如,例如,蛋白合成抑制活性、去嘌呤活性、细胞生长抑制、细胞毒性、超螺旋结构DNA松弛活性和/或核酸酶活性。

本文中使用的志贺毒素效应子功能的保留表示,如通过具有再现性的适当定量测定所测量的,与野生型志贺毒素效应子区对照相当的志贺毒素功能活性水平。对于核糖体抑制,志贺毒素效应子功能是展现10,000皮摩尔(pM)以下的IC50。对于在靶标阳性细胞杀伤测定中的细胞毒性,取决于细胞类型和其适当的细胞外靶标生物分子的表达,志贺毒素效应子功能是展现1,000纳摩尔(nM)以下的IC50

免疫毒素和配体-毒素融合物作为细胞毒性分子的有效性和功效受它们在靶细胞表面上的靶抗原的密度(参见,例如Decket T等,Blood 103:2718-26(2004);Du X等,Blood 111:338-43(2008);Baskar S等,mAbs 4:349-61(2012))、表位位置(Press O等,J Immunol 141:4410-7(1988);Godal A等,In J Cancer 52:631-5(1992);Yazdi P等,Cancer Res 55:3763-71(1995))、表面结合的细胞毒性分子的内在化的速率(参见,例如Du X等,Cancer Res 68:6300-5(2008))和细胞内路线(Tortorella L等,PLoS One 7:e47320(2012))的影响。

给定的细胞外靶标生物分子的细胞表面表现和/或密度可能影响可能最适合使用本发明的某些蛋白的应用。细胞之间给定的靶标生物分子的细胞表面表现和/或密度的差异可能定量和定性地改变给定的本发明的蛋白的内在化和/或细胞毒性。在靶标生物分子阳性的细胞之间,或者甚至在细胞周期或细胞分化的不同时间点的同一细胞上,给定的靶标生物分子的细胞表面表现和/或密度可能极大地不同。可以使用本领域技术人员已知的五分时时彩方法确定给定的靶标生物分子在特定细胞或细胞群体上的总细胞表面表现,所述五分时时彩方法诸如荧光活化细胞分选(FACS)流式细胞计数五分时时彩方法。

引言

本发明解决改造有效的细胞毒性蛋白的问题,所述细胞毒性蛋白包含与用于细胞靶向的异源结合区连接的志贺毒素亚基A来源的区域,例如,保留强健的志贺毒素效应子功能(如自我指导的向细胞溶胶的细胞内按路线发送和细胞毒性)的融合蛋白。本发明是基于这样的观察:志贺毒素亚基A来源的毒素区与异源结合区之间特定的结构关系可以影响改造的基于志贺毒素的细胞毒性蛋白的细胞杀伤效力。这些多肽的细胞内按路线发送必须足以允许酶活性的志贺毒素亚基A来源的多肽有效地到达细胞溶胶区室并且使核糖体失活,以引起细胞死亡。如在实施例中更详细地描述,相对于异源细胞靶向性结合区,具有邻近氨基端朝向的志贺毒素亚基A来源的毒素区导致的细胞杀伤比以相反方向排列的相同结构部分显著更强劲。本发明提供一种通过在细胞毒性蛋白内使细胞靶向性结合区邻近志贺毒素效应子区的羧基端排列而改造所述细胞毒性蛋白以实现此的具体五分时时彩方法。异源、细胞靶向性结合区与志贺毒素亚基A区以这种特异性方向的结合允许改造志贺毒素细胞毒性的更有效的细胞型特异性靶向,以及具有需要的向内质网和/或细胞溶胶的细胞内按路线发送的蛋白。

之前,表明志贺毒素A亚基是细胞毒性的,并且可能能够自我指导其自身的细胞内按路线发送,以将酶活性的毒素片段递送至细胞溶胶(Al-Jaufy,Infect Immun 62:956-60(1994);Al-Jaufy,Infect Immun 63:3073-8(1995);Su,蛋白Expr Purif 66:149-57(2009))。当产生并检测多种细胞毒性蛋白(志贺毒素来源的区域连接免疫球蛋白来源的靶向区的氨基端)时,这些改造的蛋白不展现预测水平的细胞毒性(见下文的实施例)。然而,与具有以不同构型连接的相同多肽区的更高细胞毒性的变体相比,这些较低细胞毒性的蛋白展现相比表面结合和进入,以及相似的体外酶活性和相似的结合亲和性(见下文的实施例)。

如实施例中进一步所述,通过改变定向,使免疫球蛋白型结合区连接在志贺毒素区的羧基邻近区域,改善了基于志贺毒素亚基A的、细胞毒性蛋白的细胞毒性。然而,改造的定向并没有改变志贺毒素来源的区域的催化活性或免疫球蛋白型结合区的结合动力学。基于志贺毒素的蛋白的细胞毒性(和细胞内按路线发送)对改造其多肽组分的定向的敏感性是出乎意料的,并且还没有得到解释。这些结果不能通过蛋白靶标结合特征、细胞结合特征或催化活性的差异得到解释。

I.本发明的蛋白的一般结构

本发明提供多种蛋白,每种蛋白包含:1)用于细胞靶向的免疫球蛋白型结合区,和2)用于细胞内在化、细胞内按路线发送和/或细胞杀伤的志贺毒素效应子区。细胞靶向性免疫球蛋白型结合区与志贺毒素亚基A来源的区域的连接能够允许改造有效的志贺毒素细胞毒性的细胞型特异性靶向。本发明的蛋白包含来源于志贺毒素家族成员的一个或多个A亚基的志贺毒素效应子区,其与免疫球蛋白型结合区连接,所述免疫球蛋白型结合区可以特异性结合与细胞物理结合的至少一种细胞外靶标生物分子,诸如在细胞表面上表达的靶标生物分子。这种一般结构是模块式的,原因在于,任意数量的多样性免疫球蛋白型结合区可以连接到志贺毒素亚基A来源的效应子区上,产生相同的一般结构的变化。

A.免疫球蛋白型结合区

本发明的蛋白的结合区包含含有一个或多个能够选择性和特异性结合细胞外靶标生物分子的多肽的免疫球蛋白型结合区。本文中使用的术语“免疫球蛋白型结合区”表示能够结合一个或多个靶标生物分子(诸如抗原或表位)的多肽区域。免疫球蛋白型结合区在功能上由它们的结合靶分子的能力来限定。免疫球蛋白型结合区通常源自抗体或抗体样结构;但是,预见到来自其它来源的替代支架在该术语的范围内。

免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被称为Ig结构域的结构域。Ig结构域的长度范围为约70-110个氨基酸残基并且拥有特征性Ig折叠,其中典型地7-9个反向平行的β链排列为两个形成夹心样结构的β片层。Ig折叠通过夹心的内表面上的疏水氨基酸相互作用和链中半胱氨酸残基之间的高度保守的二硫键来稳定。Ig结构域可以是可变的(IgV或V-组)、恒定的(IgC或C-组)或中间的(IgI或I-组)。一些Ig结构域可能与互补性决定区(CDR,还称为“互补决定区”)有关,所述互补决定区对于抗体与它们的表位的结合的特异性而言是重要的。Ig-样结构域也存在于非免疫球蛋白的蛋白中,并且基于此被分类为Ig蛋白超家族的成员。HUGO基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee,HGNC)提供了含有Ig-样结构域的家族的成员的清单。

免疫球蛋白型结合区可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列,其中例如通过分子工程改造或通过文库筛选进行选择,所述氨基酸序列已经与天然抗体或非免疫球蛋白蛋白的Ig-样结构域的氨基酸序列有所不同。因为重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区的产生中的关联性,可以重新设计抗体以获得期望的特征,诸如较小的尺寸、细胞进入(cell entry)、或其它治疗改善。可能的变化有很多,并且范围可以为从仅一个氨基酸的改变到例如可变区的完全重新设计。典型地,将做出可变区的改变以便改善抗原结合特征、改善可变区稳定性、或降低免疫原性应答的可能。

还存在众多预见到作为本发明的蛋白的组分的免疫球蛋白型结合区。在某些实施方案中,免疫球蛋白型结合区源自免疫球蛋白结合区域,诸如能够结合细胞外靶标生物分子的抗体互补位。在某些其它实施方案中,免疫球蛋白型结合区包含经工程改造的多肽,所述经工程改造的多肽并非源自任何免疫球蛋白结构域,而是通过提供对细胞外靶标生物分子的高亲和力结合而象免疫球蛋白结合区一样发挥作用。这种经工程改造的多肽可以任选地包括包含来自如本文中所述的免疫球蛋白的互补决定区或者基本上由所述互补决定区组成的多肽支架。

存在众多现有技术中的免疫球蛋白来源的结合区和非免疫球蛋白改造的多肽,其可用于通过它们的高亲和力结合特性将多肽靶向特定细胞型。在某些实施方案中,所述蛋白的免疫球蛋白型结合区选自单结构域抗体结构域(sdAb)、纳米抗体、从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段)、二价纳米抗体、从软骨鱼来源的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、多聚化scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)、双特异性的串联的scFv片段、二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定化的抗原结合(Fab)片段、二价F(ab’)2片段、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、单链Fv-CH3微抗体、双特异性微抗体、二聚CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcabs)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受限的构架区3、CDR3、构架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、多聚化scFv片段(双抗体、三抗体、四抗体)、二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定化的抗原结合(Fab)片段、二价纳米抗体、二价微抗体、二价F(ab’)2片段(Fab二聚体)、双特异性的串联的VHH片段、双特异性的串联的scFv片段、双特异性纳米抗体、双特异性微抗体、以及保留它的互补位和结合功能的前述物质的任何遗传操作的对应物(参见Saerens D等,Curr.Opin.Pharmacol 8:600-8(2008);Dimitrov D,MAbs 1:26-8(2009);Weiner L,Cell 148:1081-4(2012);Ahmad Z等,Clin Dev Immunol 2012:980250(2012))。存在多种包含来源于免疫球蛋白恒定区的多肽的结合区,诸如,例如,改造的二聚体Fc结构域、单体Fcs(mFcs)、scFv-Fcs、VHH-Fcs、CH2结构域、单体CH3s结构域(mCH3s)、合成重新设计的免疫球蛋白结构域和/或免疫球蛋白结构域与配体的杂化融合体(Hofer T等,Proc Natl Acad Sci U.S.A.105:12451-6(2008);Xiao J等,J Am Chem Soc 131:13616-13618(2009);Xiao X等,Biochem Biophys Res Commun 387:387-92(2009);Wozniak-Knopp G等,蛋白Eng Des Sel 23 289-97(2010);Gong R等,PLoS ONE 7:e42288(2012);Wozniak-Knopp G等,PLoS ONE 7:e30083(2012);Ying T等,J Biol Chem 287:19399-408(2012);Ying T等,J Biol Chem 288:25154-64(2013);Chiang M等,J Am Chem Soc 136:3370-3(2014);Rader C,Trends Biotechnol 32:186-97(2014);Ying T等,Biochimica Biophys Acta 1844:1977-82(2014))。

根据某些其它实施方案,所述免疫球蛋白型结合区包括免疫球蛋白结构域的经工程改造的替代支架。本领域中已知,改造的替代支架表现出与免疫球蛋白来源的结构类似的功能特征,诸如对靶标生物分子的高亲和力和特异性结合,并且可以为免疫球蛋白结构域提供改善的特征,诸如例如更大稳定性或降低的免疫原性。通常,对于免疫球蛋白的替代支架小于20KD,由单个多肽链组成,缺少半胱氨酸残基,并且展现相对高的热力学稳定性。

对于本发明的蛋白的某些实施方案,所述结合区包含选自包括下述的组的替代支架:经工程改造的、纤维连接蛋白来源的、第10个纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(单抗体、AdNectinsTM或AdNexinsTM);经工程改造的、生腱蛋白来源的、生腱蛋白III型结构域(CentrynsTM);经工程改造的、含有锚蛋白重复基序的多肽(DARPinsTM);经工程改造的、低密度-脂蛋白-受体来源的、A结构域(LDLR-A)(AvimersTM);脂质运载蛋白(anticalins);经工程改造的、蛋白酶抑制剂来源的、Kunitz结构域;经工程改造的、蛋白-A来源的、Z结构域(AffibodiesTM);经工程改造的、γ-B结晶来源的支架或经工程改造的、泛蛋白来源的支架(Affilins);Sac7d来源的多肽(或affitins);经工程改造的、Fyn来源的、SH2结构域小蛋白;C-型凝集素-样结构域支架;经工程经工程改造的抗体模拟物;以及保留它的结合功能性的前述物质的任何遗传操作的对应物(A,Plückthun A,J Mol Biol 305:989-1010(2001);Xu L等,Chem Biol 9:933-42(2002);Wikman M等,蛋白Eng Des Sel 17:455-62(2004);Binz H等,Nat Biotechnol 23:1257-68(2005);Hey T等,Trends Biotechnol 23:514-522(2005);Holliger P,Hudson P,Nat Biotechnol 23:1126-36(2005);Gill D,Damle N,Curr Opin Biotech 17:653-8(2006);Koide A,Koide S,Methods Mol Biol 352:95-109(2007);Byla P等,J Biol Chem 285:12096(2010);Zoller F等,Molecules 16:2467-85(2011))。

例如,已经鉴定了多种结合细胞外受体HER2的替代支架(参见例如Wikman M等,Protein Eng Des Sel 17:455-62(2004);Orlova A等Cancer Res 66:4339-8(2006);Ahlgren S等,Bioconjug Chem 19;235-43(2008);Feldwisch J等,J Mol Biol 398:232-47(2010);美国专利5,578,482;5,856,110;5,869,445;5,985,553;6,333,169;6,987,088;7,019,017;7,282,365;7,306,801;7,435,797;7,446,185;7,449,480;7,560,111;7,674,460;7,815,906;7,879,325;7,884,194;7,993,650;8,241,630;8,349,585;8,389,227;8,501,909;8,512,967;8,652,474;和美国专利申请2011/0059090)。

任何以上免疫球蛋白型结合区可以用作本发明的组分,只要所述结合区组分对细胞外靶标生物分子具有10-5至10-12摩尔/升、优选地小于200nM的解离常数即可。

细胞外靶标生物分子

本发明的蛋白的结合区包含这样的多肽区域:其能够特异性地结合细胞外靶标生物分子,优选地其物理连接至目标细胞类型(诸如癌细胞、肿瘤细胞、浆细胞、被感染的细胞或携带细胞内病原体的宿主细胞)的表面。

术语“靶标生物分子”表示这样的生物分子,通常是蛋白或通过翻译后修饰(诸如糖基化)而修饰的蛋白:其能够被结合区结合以使蛋白靶向生物体内的特定细胞类型或位置。细胞外靶标生物分子可以包括多个表位,包括未修饰的多肽、通过添加生化官能团而修饰的多肽、和糖脂(参见例如美国专利5,091,178;EP 2431743)。合乎需要的是,细胞外靶标生物分子在与本发明的蛋白相互作用以后被内源性地内化或容易地被迫内化。

就本发明的目的而言,关于修饰靶标生物分子,术语“细胞外的”表示这样的生物分子:它的结构的至少一部分暴露于细胞外环境。细胞外靶标生物分子包括细胞膜组分、跨膜蛋白、细胞膜锚定的生物分子、细胞表面结合的生物分子和分泌的生物分子。

关于本发明,当用于描述靶标生物分子时,短语“物理连接”是指将靶标生物分子或其部分与细胞外部关联的共价和/或非共价分子间相互作用,诸如靶标生物分子和细胞之间的多个非共价相互作用,其中每个单独相互作用的能量是在约1-5千卡的量级(例如静电键、氢键、范德华相互作用、疏水力等)。可以发现所有嵌膜蛋白与细胞膜、以及周围膜蛋白物理连接。例如,细胞外靶标生物分子可能包含跨膜区域、脂质锚、糖脂锚和/或与包含前述任一种的因子非共价地结合(例如通过非特异性疏水相互作用和/或结合脂质的相互作用)。

本发明的蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子可以包括在癌细胞、免疫细胞和感染了细胞内病原体(诸如病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物)的细胞上过比例或排他性地存在的生物标记。

可以基于众多标准(诸如它们的靶标生物分子的细胞类型特异性的表达和/或它们的靶标生物分子关于特定细胞类型的物理定位)来设计或选择本发明的蛋白的结合区。例如,本发明的某些蛋白包含这样的结合结构域:其能够使由仅一种细胞类型排他地表达的细胞表面靶标结合至细胞表面。

本发明的蛋白的一般结构是模块式的,原因在于,多个多样性的免疫球蛋白型结合区可以与相同的志贺毒素效应子区一起使用,以提供多种细胞外靶标生物分子的多样性靶向,并且由此使细胞毒性、白细胞淤积、诊断剂和/或外源物质递送靶向多种不同的细胞型。

B.来源于志贺毒素家族成员的A亚基的志贺毒素效应子区

就本发明的目的而言,短语“志贺毒素效应子区”是指来源于志贺毒素家族的成员的志贺毒素A亚基的多肽区域,其能够展现至少一种志贺毒素功能。志贺毒素功能包括,例如,细胞进入、脂质膜变形、指导亚细胞按路线发送、避免降解、催化灭活核糖体、实施细胞毒性和实施细胞生长抑制作用。

志贺毒素家族成员是指在结构和功能上相关的天然存在的蛋白毒素、特别是从痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)和大肠杆菌(E.coli)分离的毒素的家族的任何成员(Johannes,Nat RevMicrobiol 8:105-16(2010))。例如,志贺毒素家族包括从痢疾志贺氏菌血清型1中分离的真正志贺毒素(Stx),从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素1变体(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I),以及从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx仅一个残基不同,并且二者都被称为维罗细胞毒素(Verocytotoxins)或维罗毒素(Verotoxins)(VTs)(O’Brien,Curr Top Microbiol Immunol 180:65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体在氨墓酸序列水平上彼此仅有约53-60%的相似性,但是它们享有志贺毒素家族成员共有的酶活性和细胞毒性的机制(Johannes,Nat Rev Microbiol 8:105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺毒素,如定义的亚型Stx1a、Stx1c、Stx1d、和Stx2a-g(Scheutz F等,J Clin Microbiol 50:2951-63(2012))。志贺毒素家族成员并不天然地限于任何细菌物种,因为编码志贺毒素的基因可以经由水平基因转移在细菌物种之间传播(Strauch E等,Infect Immun 69:7588-95(2001);Zhaxybayeva O,Doolittle W,Curr Biol 21:R242-6(2011))。作为物种间转移的实例,在从患者中分离的溶血不动杆菌(A.haemolyticus)的菌株中发现了志贺毒素(Grotiuz G等,J Clin Microbiol 44:3838-41(2006))。一旦编码志贺毒素的多核苷酸进入新的亚种或物种,则假定志贺毒素氨基酸序列能够由于遗传漂变和/或选择压力发展少量序列变化而同时仍然保持志贺毒素家族成员共有的细胞毒性的机制(参见Scheutz,J Clin Microbiol 50:2951-63(2012))。

本发明的志贺毒素效应子区包含源于从其天然志贺毒素B亚基的任何形式解离的志贺毒素A亚基的多肽或者基本上由其组成。此外,本发明的蛋白不含任何包含志贺毒素B亚基的功能结合结构域或者基本上由其组成的多肽。相反,源于志贺毒素A亚基的区域与异源免疫球蛋白型结合区在功能上相关联从而实现细胞靶向。

在某些实施方案中,本发明的志贺毒素效应子区可以包含全长志贺毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)或SLT-2A(SEQ ID NO:3)),或者基本上由其组成,应注意的是,天然存在的志贺毒素A亚基可以包括前体形式,所述前体形式在其氨基端含有约22个氨基酸的信号序列,所述信号序列被移除从而产生成熟的志贺毒素A亚基,并且是技术人员能识别的。在其它实施方案中,本发明的志贺毒素效应子区包含比全长志贺毒素A亚基短的截短的志贺毒素A亚基,或者基本上由其组成。

志贺样毒素1A亚基截短是具有催化活性的,能够在体外使核糖体酶促失活,并且当在细胞内表达时是具有细胞毒性的(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。展现出完全酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。尽管报道的保持基本催化活性的志贺毒素A亚基的最小片段是StxA的残基75-247(Al-Jaufy,Infect Immun62:956-60(1994)),在真核细胞内从头(de novo)表达的StxA截短仅需要至多残基240以到达细胞溶胶并且进行核糖体的催化失活(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。

志贺毒素效应子区通常可以少于全长A亚基。优选的是,志贺毒素效应子区保留从氨基酸位置77至239的多肽区(SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2))或志贺毒素家族成员的其他A亚基的等同物(例如(SEQ ID NO:3)的77-238)。例如,在本发明的某些实施方案中,来源于SLT-1A的志贺毒素效应子区可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸75至251、SEQ ID NO:1的1至241、SEQ ID NO:1的1至251、或SEQ ID NO:1的氨基酸1至261,或者基本上由其组成。在某些其他实施方案中,来源于StxA的志贺毒素效应子区可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸75至251、SEQ ID NO:2的1至241、SEQ ID NO:2的1至251、或SEQ ID NO:2的氨基酸1至261,或者基本上由其组成。在某些其他实施方案中,来源于SLT-2的志贺毒素效应子区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸75至251、SEQ ID NO:3的1至241、SEQ ID NO:3的1至251、或SEQ ID NO:3的氨基酸1至261,或者基本上由其组成。

本发明还提供了本发明的蛋白的变体,其中志贺毒素效应子区与天然存在的志贺毒素A亚基至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个氨基酸残基不同(但是不多于保持至少85%、90%、95%、99%以上氨基酸序列同一性的氨基酸残基数目)。因此,来源于志贺毒素家族成员的A亚基的多肽区可以包含增加、缺失、截短、或相对于原始序列的其他改变,只要维持与天然存在的志贺毒素A亚基至少85%、90%、95%、99%以上的氨基酸序列同一性即可。

因此,在某些实施方案中,志贺毒素效应子区包含与天然存在的志贺毒素A亚基(如SLT-1A(SEQ ID NO:1),Stx(SEQ ID NO:2),和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3))具有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.5%或99.7%整体序列同一性的氨基酸序列,或者基本上由其组成。

任选地,志贺毒素A亚基的全长或截短形式可以包含一个或多个突变(例如置换、缺失、插入或倒置)。在某些实施方案中,优选地,志贺毒素效应子区与天然存在的志贺毒素A亚基具有足够的序列同一性,以在进入细胞后保持细胞毒性,所述进入细胞通过宿主细胞转化、转染、感染或诱导的已知五分时时彩方法,或者通过与志贺毒素效应子区连接的细胞靶向性免疫球蛋白型结合区介导的内在化进行。志贺毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性最重要的残基被绘图定位至以下残基位置:特别是天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、和精氨酸-176(Di,Toxicon 57:535-39(2011))。在本发明的实施方案中的任一个中,志贺毒素效应子区可以优选地但不是必须地保留在下述位置的一个或多个保守氨基酸:诸如在StxA、SLT-1A的位置77、167、170和176处的保守氨基酸,或在志贺毒素家族其他成员中典型地是细胞毒性活性所需要的等价保守位置。本发明的细胞毒性蛋白引起细胞死亡的能力,例如,其细胞毒性,可以使用本领域公知的多种测定中的任一种或多种进行测量。

在本发明的某些实施方案中,一个或多个氨基酸残基可以被突变、插入或缺失,以增加志贺毒素效应子区的酶活性。例如,将StxlA中残基位置丙氨酸-231突变为谷氨酸增加其体外酶活性(Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9(1998))。

在本发明的某些实施方案中,可以将一个或多个氨基酸残基突变或缺失以便降低或消除志贺毒素效应子区的催化和/或细胞毒性活性。可以通过突变或截短来降低或消除志贺毒素家族成员的A亚基的催化和/或细胞毒性。已经显示标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置对于Stx、Stx1和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等,Proc Natl Acad Sci USA 85:2568-72(1988);Deresiewicz R等,Biochemistry 31:3272-80(1992);Deresiewicz R等,Mol Gen Genet 241:467-73(1993);Ohmura M等,Microb Pathog 15:169-76(1993);Cao C等,Microbiol Immunol 38:441-7(1994);Suhan,Infect Immun 66:5252-9(1998))。在无细胞核糖体失活测定中,将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变消除了Slt-I A1的酶活性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在利用内质网中Slt-I A1的从头表达的另一种五分时时彩方法中,将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变在所述表达水平上消除了Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短分析表明,StxA的残基75至268的片段在体外仍然保持明显的酶活性(Haddad,J Bacteriol 175:4970-8(1993))。借助在细胞溶胶中的从头表达,含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段显示出明显的体外酶活性和细胞毒性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达不具有细胞毒性,因为其不能逆移位至细胞溶胶中(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。

用于本文时,保留“显著的”志贺毒素效应子功能是指,通过具有再现性的适当的定量测定测量的,与野生型志贺毒素效应子多肽对照相当的志贺毒素功能活性水平。对于体外核糖体抑制,显著的志贺毒素效应子功能是展现300pM以下的IC50,这取决于核糖体的来源(例如,细菌、古细菌(archaea)或真核生物(藻类,真菌,植物或动物))。与催化失活的SLT-1A 1-251双重突变体(Y77S/E167D)的约100,000pM的IC50相比,这是显著更大的抑制作用。对于在实验室细胞培养物中的靶标阳性细胞杀伤测定中的细胞毒性,显著的志贺毒素效应子功能是展现100、50或30nM以下的CD50,这取决于细胞系和其对适当的细胞外靶标生物分子的表达。与单独的没有细胞靶向性结合区的SLT-1A组分(其具有100-10,000nM的CD50)相比,这是对适当的靶细胞系显著更高的细胞毒性,其取决于细胞系。

对于一些样品,由于不能收集必要的数据点进行准确的曲线拟合,IC50或CD50的准确值可能是不能获得的。当确定显著的志贺毒素效应子功能活性时,不应该考虑不准确的IC50和/或CD50值。在示例性的志贺毒素效应子功能测定(诸如,例如,在实施例中所述的测定)的数据分析中描述为不足以准确拟合曲线的数据不应该被认为代表实际的志贺毒素效应子功能。例如,如果在给定样品的浓度系列中分别不发生大于50%的核糖体抑制或细胞死亡,则理论上不可能确定IC50和CD50

不能检测志贺毒素效应子功能的活性可能是由于不适当的表达、多肽折叠、和/或多肽稳定性,而不是缺少细胞进入、亚细胞按路线发送和/或酶活性。志贺毒素效应子功能的测定可能不需要很多本发明的多肽来测量显著量的志贺毒素效应子功能活性。在凭经验确定低或没有效应子功能的潜在的原因与蛋白表达或稳定性相关的程度上,本领域技术人员可以能够利用本领域已知的蛋白化学和分子改造技术抵消这些因素,使得志贺毒素功能性效应子活性可以被恢复并测量。例如,基于不适当的细胞的表达可以通过使用不同的表达控制序列进行抵消;不适当的多肽折叠和/或稳定性可以受益于稳定末端序列、或稳定蛋白三维结构的非效应子区中的补偿性突变等。当关于个体志贺毒素功能的新测定可用时,可以分析志贺毒素效应子区或多肽的任意水平的这些志贺毒素效应子功能,诸如是野生型志贺毒素效应子多肽的活性的特定倍数的活性以内。有意义的活性差异的实例是,例如,具有是野生型志贺毒素效应子多肽的活性的1000-倍或100-倍以下的活性的志贺毒素效应子区;或与功能性敲低或敲除的志贺毒素效应子多肽相比,具有3-倍至30-倍或更高的活性的志贺毒素效应子区。

某些志贺毒素效应子功能是不容易测量的,例如,亚细胞按路线发送功能。目前没有途径、定量测定区分志贺毒素效应子多肽不是细胞毒性的是否是由于不正确的亚细胞按路线发送,但是,在测试可用的时候,可以与适当的野生型志贺毒素效应子区相比,分析志贺毒素效应子多肽任意显著水平的亚细胞按路线发送。

应该注意,即使志贺毒素效应子多肽的细胞毒性相对于野生型减少了,在实践中,使用减毒的志贺毒素效应子多肽的应用可以与使用野生型志贺毒素效应子多肽一样有效或更有效,原因在于,功效最高的变体可能展现不需要的作用,而在功效降低的变体中不需要的作用减至最小。野生型志贺毒素效应子多肽是非常有效的,能够仅以到达细胞溶胶的一个分子或内在化的大约40个分子进行杀伤。与野生型志贺毒素效应子多肽相比,具有甚至相当减少的志贺毒素效应子功能(诸如,例如,亚细胞按路线发送或细胞毒性)的志贺毒素效应子多肽,对于涉及靶向的细胞杀伤和/或特定的细胞检测的实际应用,可能仍然是足够有效的。

为了本发明的目的,志贺毒素效应子区和免疫球蛋白型结合区的特定次序或定向是固定的,使得与志贺毒素效应子区的氨基端相比,所述免疫球蛋白型结合区在蛋白内更邻近志贺毒素效应子区的羧基端(参见,例如,图1)。

相对于彼此或整个蛋白的N-端和C-端的具体顺序或定向不是固定的(例如,参见图1)。在本发明的蛋白的上述实施方案中,结合区、志贺毒素效应子区(其可以是由细胞毒性的和/或携带一个或多个降低或消除催化活性和/或细胞毒性的突变)可以彼此直接连接和/或经由一个或多个插入的多肽序列彼此适合地连接,如利用一个或多个在本领域内公知的和/或本文所述的接头连接。

C.连接本发明的多肽组分和/或它们的亚组分的连接键

本发明的各个多肽和/或蛋白组分,例如结合区和志贺毒素效应子区(其可以是有细胞毒性的和/或携带一个或多个改变、降低或消除催化活性和/或细胞毒性的突变),可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接。结合区的各个多肽亚组分,例如CDR和/或ABR区,可以通过本领域众所周知的和/或本文描述的一个或多个接头适当地彼此连接(例如,参见Weisser N,Hall J,Biotechnol Adv 27:502-20(2009);Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。本发明的蛋白组分,例如,多链结合区域,可以通过本领域众所周知的一个或多个接头适当地彼此连接或连接至本发明的其它多肽组分。本发明的肽组分,例如,KDEL家族内质网保留/回收信号基序,可以通过本领域众所周知的一个或多个接头(诸如蛋白性接头)适当地连接至本发明的另一个组分。

合适的接头通常是允许本发明的每个多肽组分以这样的三维结构折叠的那些接头,所述三维结构非常类似于在没有任何接头或其它组分的情况下单独产生的多肽组分。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺乏前述任一种的接头,诸如例如各种非蛋白性的碳链,无论是分支的还是环状的(例如,参见Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。

合适的接头可以是蛋白性的,且包含一个或多个氨基酸、肽和/或多肽。蛋白性的接头适合用于重组融合蛋白和化学连接的缀合物。蛋白性的接头典型地具有约2至约50个氨基酸残基,诸如,例如,约5至约30个或约6至约25个氨基酸残基。选择的接头的长度取决于多种因素,诸如,例如,选择所述接头所期望的一种或多种性质(例如,参见Chen X等,Adv DrugDeliv Rev 65:1357-69(2013))。

合适的接头可以是非蛋白性的,例如,化学接头(例如,参见Dosio F等,Toxins 3:848-83(2011);Feld J等,Oncotarget 4:397-412(2013))。本领域已知的各种非蛋白性的接头可以用于连接结合区和志贺毒素效应子区,诸如常用于将免疫球蛋白来源的多肽缀合至异源多肽的接头。例如,使用它们的氨基酸残基的功能侧链和碳水化合物结构部分(诸如,例如,羧基、胺、巯基、羧酸、羰基、羟基和/或环状环基),可以连接本发明的蛋白的多肽区域。例如,二硫键和硫醚键可以用于连接两个或更多个多肽(参见例如Fitzgerald D等,Bioconjugate Chem 1:264-8(1990);Pasqualucci L等,Haematologica 80:546-56(1995))。另外,非天然的氨基酸残基可以与其它功能侧链诸如酮基一起使用(参见例如Sun S等,Chembiochem Jul 18(2014);Tian F等,Proc Natl Acad Sci USA 111:1766-71(2014))。非蛋白性化学接头的例子包括、但不限于:N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯,S-(N-琥珀酰亚胺基)硫代乙酸酯(SATA),N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT),N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP),琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸酯(SMCC或MCC),磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯,4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯,磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基)己酸酯,N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯,磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸酯,马来酰亚胺基己酰基(MC),马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(MC-vc-PAB),3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS),α-烷基衍生物,磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀酰亚胺基N-[3-(乙酰基硫基)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸]),磺基二氯苯酚,2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane),3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰基酰肼,Ellman氏试剂,二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸(参见例如Thorpe P等,Eur J Biochem 147:197-206(1985);Thorpe P等,Cancer Res 47:5924-31(1987);Thorpe P等,Cancer Res 48:6396-403(1988);Grossbard M等,Blood 79:576-85(1992);Lui C等,Proc Natl Acad Sci USA 93:8618-23(1996);Doronina S等,Nat Biotechnol 21:778-84(2003);Feld J等,Oncotarget 4:397-412(2013))。

合适的接头(无论是蛋白性的还是非蛋白性的)可以包括,例如,蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头(参见例如Dosio F等,Toxins 3:848-83(2011);Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013);Feld J等,Oncotarget 4:397-412(2013))。

可以选择蛋白性的接头用于掺入本发明的重组融合蛋白中。例如,本发明的蛋白的组分多肽或它们的亚组分可以通过一个或多个包含一个或多个氨基酸、肽和/或多肽的接头连接。对于本发明的重组融合蛋白,接头典型地包含约2-50个氨基酸残基,优选约5-30个氨基酸残基(Argos P,JMol Biol 211:943-58(1990);Williamson M,Biochem J 297:240-60(1994);George R,Heringa J,Protein Eng 15:871-9(2002);Kreitman R,AAPS J 8:E532-51(2006))。通常,蛋白性的接头包含大多数具有极性的、不带电荷的和/或带电荷的残基的氨基酸残基,诸如,例如,苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸(参见例如Huston J等Proc Natl Acad Sci U.S.A.85:5879-83(1988);Pastan I等,Annu Rev Med 58:221-37(2007);Li J等,Cell Immunol 118:85-99(1989);Cumber A等Bioconj Chem 3:397-401(1992);Friedman P等,Cancer Res 53:334-9(1993);Whitlow M等,Protein Engineering 6:989-95(1993);Siegall C等,J Immunol 152:2377-84(1994);Newton等Biochemistry 35:545-53(1996);Ladurner等J Mol Biol 273:330-7(1997);Kreitman R等,Leuk Lymphoma 52:82-6(2011);U.S.4,894,443)。蛋白性的接头的非限制性例子包括丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE)、缬氨酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G2-4S)xAM,其中G是甘氨酸,S是丝氨酸,且x是1-10的整数。

可以基于期望的性能选择蛋白性的接头。技术人员可以记住特定特征来选择蛋白性的接头,诸如以优化融合分子的折叠、稳定性、表达、溶解度、药代动力学性能、药效动力学性能和/或在融合构建体的背景下融合的结构域的活性(相对于相同结构域自身的活性)中的一种或多种。例如,可以基于柔性、刚度和/或切割性选择蛋白性的接头(参见例如Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。技术人员在选择接头时可以使用数据库和接头设计软件工具。可以选择某些接头以优化表达(参见例如Turner D等,J Immunl Methods 205:43-54(1997))。可以选择某些接头以促进相同多肽或蛋白之间(以形成同型多聚体)或不同多肽或蛋白之间(以形成异型多聚体)的分子间相互作用。例如,可以选择蛋白性的接头,其允许本发明的蛋白的多肽组分之间的期望的非共价相互作用,诸如,例如,与二聚体和其它更高级多聚体的形成有关的相互作用(参见例如U.S.4,946,778)。

柔性的蛋白性的接头经常具有大于12个氨基酸残基的长度,且富含小的、非极性的氨基酸残基、极性的氨基酸残基和/或亲水的氨基酸残基,诸如,例如,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸(参见例如Bird R等,Science 242:423-6(1988);Friedman P等,Cancer Res 53:334-9(1993);Siegall C等,J Immunol 152:2377-84(1994))。可以选择柔性的蛋白性的接头以增加组分之间的空间分离和/或允许组分之间的分子内相互作用。例如,多种“GS”接头是技术人员已知的,且由多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸组成,有时在重复单元中,例如(GxS)n,(SxG)n,(GGGGS)n和(G)n,其中x是1-6,且n是1-30(参见例如WO 96/06641)。柔性的蛋白性的接头的非限制性例子包括GKSSGSGSESKS,GSTSGSGKSSEGKG,GSTSGSGKSSEGSGSTKG,GSTSGSGKSSEGKG,GSTSGSGKPGSGEGSTKG,EGKSSGSGSESKEF,SRSSG,和SGSSC。

刚性的蛋白性的接头经常是坚硬的α-螺旋结构且富含脯氨酸残基和/或一个或多个在战略上放置的脯氨酸(参见Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。可以选择刚性的接头以防止连接的组分之间的分子内相互作用。

可以选择合适的接头以允许组分的体内分离,例如,由于切割和/或环境特异性的不稳定性(参见Dosio F等,Toxins 3:848-83(2011);Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。体内可切割的蛋白性的接头能够通过蛋白水解加工和/或还原环境(经常在生物体内的特定部位或在特定细胞类型内)而解连(参见例如Doronina S等,Bioconjug Chem 17:144-24(2006);Erickson H等,Cancer Res 66:4426-33(2006))。体内可切割的蛋白性的接头经常包含蛋白酶敏感的基序和/或由一个或多个半胱氨酸对形成的二硫键(参见例如Pietersz G等,Cancer Res 48:4469-76(1998);The J等,J Immunol Methods 110:101-9(1998);参见Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。可以将体内可切割的蛋白性的接头设计成对仅存在于生物体中的某些位置、细胞内的区室的蛋白酶敏感,和/或仅在某些生理学或病理学状况下变得有活性(例如,具有异常高水平的蛋白酶,在某些疾病部位过表达的蛋白酶,和由病原性微生物特异性地表达的蛋白酶)。例如,存在本领域已知的蛋白性的接头,其被仅存在于细胞内的蛋白酶、仅存在于特定细胞类型内的蛋白酶和仅在病理学状况(如癌症或炎症)下存在的蛋白酶切割,例如,R-x-x-R基序和AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM。

在本发明的蛋白的某些实施方案中,可以使用这样的接头:其包含一个或多个蛋白酶敏感的位点以提供存在于靶细胞内的蛋白酶的切割。在本发明的蛋白的某些实施方案中,可以使用不可切割的接头以在施用给脊椎动物生物体以后降低不希望的毒性(参见例如Polson等,Cancer Res 69:2358-(2009))。

合适的接头可以包括,例如,蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头,无论是蛋白性的还是非蛋白性的(参见Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013))。

合适的可切割的接头可以包括含有本领域已知的可切割基团的接头,诸如,例如,Zarling D等,J Immunol 124:913-20(1980);Jung S,Moroi M,Biochem Biophys Acta 761:152-62(1983);Bouizar Z等,Eur J Biochem 155:141-7(1986);Park L等,J Biol Chem 261:205-10(1986);Browning J,Ribolini A,J Immunol 143:1859-67(1989);Joshi S,Burrows R,JBiol Chem 265:14518-25(1990))。

合适的接头可以包括pH敏感的接头。例如,可以由于它们在较低pH环境中的不稳定性而选择某些合适的接头以提供在靶细胞的亚细胞区室内的解离。例如,包含一个或多个三苯甲基、衍生化的三苯甲基、双马来酰亚胺othoxy丙烷基团(bismaleimideothoxy propane groups)、己二酸二酰肼基和/或酸不稳定的转铁蛋白基团的接头可以提供本发明的组分(例如多肽组分)在具有特定pH范围的环境中的释放(参见例如H等,JBiol Chem 266:4309-14(1991);Fattom A等,Infect Immun 60:584-9(1992))。可以选择在特定pH范围被切割的某些接头,所述特定pH范围对应于组织之间的生理pH差异,诸如,例如,肿瘤组织的pH低于健康组织中的pH(参见例如US 5,612,474)。

光可切割的接头是在暴露于某些波长范围的电磁辐射(诸如可见范围内的光)后被切割的接头(参见例如Goldmacher V等,Bioconj Chem 3:104-7(1992))。光可切割的接头可以用于在暴露于某些波长的光以后释放本发明的蛋白的组分(例如多肽组分)。光可切割的接头的非限制性例子包括硝基苄基(作为半胱氨酸的光可切割的保护基)、硝基苄氧基碳酰氯交联剂、羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物(Hazum E等,Pept Proc Eur Pept Symp,16th,Brunfeldt K,ed.,105-110(1981);Senter等,Photochem Photobiol 42:231-7(1985);Yen等,Makromol Chem 190:69-82(1989);Goldmacher V等,Bioconj Chem3:104-7(1992))。光可切割的接头可以在连接组分以形成本发明的蛋白(其被设计成用于治疗可以使用纤维光学暴露于光的疾病、病症和病患)中具有特定用途。

在本发明的蛋白的某些实施方案中,使用任意数目的技术人员已知的方式,包括共价键和非共价键,将细胞靶向性结合区域连接至志贺毒素效应子区(参见例如Chen X等,Adv Drug Deliv Rev 65:1357-69(2013);Behrens C,Liu B,MAbs 6:46-53(2014)。

在本发明的蛋白的某些实施方案中,所述蛋白包含结合区域,所述结合区域是具有连接重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的接头的scFv。存在众多本领域已知的适合用于此目的的接头,诸如,例如,15-残基(Gly4Ser)3肽。可以用于形成非共价多价结构的合适的scFv接头包括GGS,GGGS(Gly3Ser或G3S),GGGGS(Gly4Ser或G4S),GGGGSGGG,GGSGGGG,GSTSGGGSGGGSGGGGSS,和GSTSGSGKPGSSEGSTKG(Plückthun A,Pack P,Immunotechnology 3:83-105(1997);Atwell J等,Protein Eng 12:597-604(1999);Wu A等,Protein Eng 14:1025-33(2001);Yazaki P等,J Immunol Methods 253:195-208(2001);Carmichael J等,JMol Biol 326:341-51(2003);Arndt M等,FEBS Lett 578:257-61(2004);Bie C等,World J Hepatol 2:185-91(2010))。

用于连接本发明的蛋白的组分的合适五分时时彩方法可以是通过目前本领域已知的用于实现该目的的任意五分时时彩方法,只要所述连接不会实质上阻碍结合区的结合能力、蛋白的细胞内在化和/或当通过适当测定(包括本文描述的测定)测量的志贺毒素效应子区的期望的毒素效应子功能即可。

II.本发明的蛋白的特异性结构变化的实例

在本发明的某些实施方案中,本发明的蛋白包含来源于免疫球蛋白型多肽的结合区,针对与癌细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合选择所述结合区,其中所述抗原在癌细胞中的表达是受限的(参见Glokler J等,Molecules 15:2478-90(2010);Liu Y等,Lab Chip 9:1033-6(2009))。按照其他实施方案,所述结合区针对与癌细胞的细胞表面上的表面抗原的特异性和高亲和力结合进行选择,其中所述抗原较非癌症细胞由癌细胞过表达或优先表达。一些代表性的靶标生物分子包括,但不限于,下文列举的与癌症和/或特异性免疫细胞型相关的靶标。

现有技术中存在许多种识别与癌细胞相关的表位的免疫球蛋白型结合区,诸如靶向下述的结合区(括号中是备用名称):膜联蛋白AI,B3黑素瘤抗原,B4黑素瘤抗原,CD2,CD3,CD4,CD20(B-淋巴细胞抗原蛋白CD20),CD22,CD25(白介素-2受体IL2R),CD30(TNFRSF8),CD38(环形ADP核糖水解酶),CD40,CD44(透明质酸受体),ITGAV(CD51),CD66,CD71(转铁蛋白受体),CD73,CD74(HLA-DR抗原-相关的不变链),CD79,CD98,内皮糖蛋白(END或CD105),CD106(VCAM-1),4型趋化因子受体(CDCR-4,融合素,CD184),CD200,胰岛素样生长因子1受体(CD221),粘蛋白1(MUC1,CD227),基细胞粘附分子(B-CAM或CD239),CD248(内皮唾液酸蛋白或TEM1),肿瘤坏死因子受体10b(TNFRSF10B,CD262),肿瘤坏死因子受体13B(TNFRSF13B,TACI,CD276),血管内皮生长因子受体2(KDR,CD309),上皮细胞粘附分子(EpCAM,CD326),人表皮生长因子受体2(HER2/Neu/ErbB2/CD340),癌症抗原15-3(CA15-3),癌症抗原19-9(CA 19-9),癌症抗原125(CA125,MUC16),CA242,癌胚抗原-相关的细胞粘附分子(例如,CEACAM3(CD66d)和CEACAM5),癌胚抗原蛋白(CEA),硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSP4,MCSP,NG2),CTLA4,DLL4,表皮生长因子受体(EGFR/ErbB1),叶酸受体(FOLR),G-28,神经节苷脂GD2,神经节苷脂GD3,HLA-Dr10,HLA-DRB,人表皮生长因子受体1(HER1),Ephrin型-B受体2(EphB2),上皮细胞粘附分子(EpCAM),成纤维细胞激活蛋白(FAP/seprase),胰岛素样生长因子1受体(IGF1R),白介素2受体(IL-2R),白介素6受体(IL-6R),整联蛋白α-V β-3(αVβ3),整联蛋白α-V β-5(αvβ5),整联蛋白α-5 β-1(α5β1),L6,MPG,黑素瘤-相关的抗原1蛋白(MAGE-1),黑素瘤-相关的抗原3(MAGE-3),mesothelin(MSLN),MPG,MS4A,p21,p97,脊髓灰质炎病毒受体-样4(PVRL4),蛋白酶-活化的-受体(诸如PAR1),前列腺-特异性膜抗原蛋白(PSMA),营养细胞糖蛋白(TPGB),和肿瘤-相关的钙信号转导蛋白(TACSTDs)(参见,例如,Lui B等,Cancer Res 64:704-10(2004);Novellino L等,Cancer Immunol Immunother 54:187-207(2005);Bagley R等,Int J Oncol 34:619-27(2009);Gerber H等,mAbs 1:247-53(2009);Beck A等,Nat Rev Immunol 10:345-52(2010);Andersen J等,JBiol Chem 287:22927-37(2012);Nolan-Stevaux O等,PLoS One 7:e50920(2012);Rust S等,Mol Cancer 12:11(2013))。该靶标生物分子的列表旨在是非限制性的。技术人员应该理解,可以使用任何与癌细胞或其他需要的细胞类型相关的靶标生物分子来设计或选择与志贺毒素效应子区连接的结合区,从而产生本发明的蛋白。

与癌细胞强烈相关的并且具有已知与癌细胞结合的免疫球蛋白型结合区的其他靶标生物分子的实例包括BAGE蛋白(B黑素瘤抗原),基细胞粘附分子(BCAMs或Lutheran血型糖蛋白),膀胱肿瘤抗原(BTA),睾丸癌抗原NY-ESO-1,睾丸癌抗原LAGE蛋白,CD19(B-淋巴细胞抗原蛋白CD19),CD21(补体受体-2或补体3d受体),CD26(二肽基肽酶-4,DPP4,或腺苷脱氨酶复合蛋白2),CD33(唾液酸-结合免疫球蛋白-型凝集素-3),CD52(CAMPATH-1抗原),CD56(神经细胞粘附分子或NCAM),CD133(prominin-1),CS1(SLAM家族7号或SLAMF7),细胞表面A33抗原蛋白(gpA33),EB病毒抗原蛋白,GAGE/PAGE蛋白(黑素瘤相关的癌症/睾丸抗原),肝细胞生长因子受体(HGFR或c-Met),MAGE蛋白,由T细胞1蛋白识别的黑素瘤抗原(MART-1/MelanA,MARTI),粘蛋白,优先表达的黑素瘤抗原(PRAME)蛋白,前列腺特异性的抗原蛋白(PSA),前列腺干细胞抗原蛋白(PSCA),晚期糖基化终产物受体(Receptor for Advanced Glycation Endroducts(RAGE)),肿瘤相关的糖蛋白72(TAG-72),酪氨酸-蛋白激酶跨膜受体(ROR1或NTRKR1),血管内皮生长因子受体(VEGFRs),和肾母细胞瘤(Wilms’tumor)抗原。

其他与癌细胞强烈相关的靶标生物分子的实例是碳酸酐酶IX(CA9/CAIX),Claudin蛋白(CLDN3,CLDN4),蝶素(ephrin)型-A受体3(EphA3),叶酸结合蛋白(FBP),神经节苷脂GM2,胰岛素样生长因子受体,整联蛋白(诸如CD11a-c),核因子κ B的受体激活剂(RANK),受体酪氨酸-蛋白激酶erB-3,肿瘤坏死因子受体10A(TRAIL-R1/DR4),肿瘤坏死因子受体10B(TRAIL-R2),生腱蛋白C,和CD64(FcγRI)(参见Hough C等,Cancer Res 60:6281-7(2000);Thepen T等,Nat Biotechnol 18:48-51(2000);Pastan I等,Nat Rev Cancer 6:559-65(2006);Pastan,Annu Rev Med 58:221-37(2007);Fitzgerald D等,Cancer Res 71:6300-9(2011);Scott A等,Cancer Immun 12:14-22(2012))。该靶标生物分子的列表旨在是非限制性的。

另外,存在所考虑的靶标生物分子的多种其他的实例,诸如ADAM金属蛋白酶(例如,ADAM-9,ADAM-10,ADAM-12,ADAM-15,ADAM-17),ADP-核糖基转移酶(ART1,ART4),抗原F4/80,骨髓间质抗原(BST1,BST2),断点簇区-c-abl癌基因(break point cluster region-c-abl oncogene(BCR-ABL))蛋白,C3aR(补体成分3a受体),CD7,CD13,CD14,CD15(Lewis X或阶段特异胚抗原1),CD23(FC ε RII),CD49d,CD53,CD54(细胞内粘附分子1),CD63(四跨膜蛋白(tetraspanin)),CD69,CD80,CD86,CD88(补体成分5a受体1),CD115(集落刺激因子1受体),CD123(白介素-3受体),CD129(白介素9受体),CD183(趋化因子受体CXCR3),CD191(CCR1),CD193(CCR3),CD195(趋化因子受体CCR5),CD203c,CD225(干扰素-诱导的跨膜蛋白1),CD244(天然杀伤细胞受体2B4),CD282(toll-样受体2),CD284(Toll-样受体4),CD294(GPR44),CD305(白细胞-相关的免疫球蛋白-样受体1),蝶素型-A受体2(EphA2),FceRIa,半乳凝集素-9,甲胎蛋白抗原17-A1蛋白,人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶(HAAH),,免疫球蛋白-样转录物ILT-3,溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1(LPGAT1/IAA0205),溶酶体-相关的膜蛋白(LAMPs,诸如CD107),黑素细胞蛋白PMEL(gp100),骨髓-相关的蛋白-14(mrp-14),程序性死亡配体1(PD-L1),受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-3,SART蛋白,清道夫受体(诸如CD64和CD68),Siglecs(唾液酸-结合免疫球蛋白-型凝集素),多配体聚糖(诸如SDC1或CD138),酪氨酸酶,酪氨酸酶-相关的蛋白1(TRP-1),酪氨酸酶-相关的蛋白2(TRP-2),酪氨酸酶相关的抗原(TAA),APO-3,BCMA,CD2,CD3,CD4,CD8,CD18,CD27,CD28,CD29,CD41,CD49,CD90,CD95(Fas),CD103,CD104,CD134(OX40),CD137(4-1BB),CD152(CTLA-4),趋化因子受体,补体蛋白,细胞因子受体,组织相容性蛋白,ICOS,白介素-α,白介素-β,c-myc,骨保护素,PD-1,RANK,TACI,TNF受体超家族成员(TNF-R1,TNFR-2),Apo2/TRAIL-R1,TRAIL-R2,TRAIL-R3,和TRAIL-R4(参见Scott A等,Cancer Immun 12:14(2012);Cheever M等,Clin Cancer Res 15:5323-37(2009)),关于靶标生物分子,并且注意本文所述的靶标分子是非限制性的实例)。技术人员应该理解,可以使用任何需要的靶标生物分子来设计或选择要与志贺毒素效应子区连接的结合区,以产生本发明的蛋白。

在某些实施方案中,所述结合区包含针对与免疫系统细胞类型的细胞表面的特异性和高亲和力结合选择的免疫球蛋白型多肽或基本上由其组成。例如,已知结合下述的免疫球蛋白型结合结构域:CD1,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD9,CD10,CD11,CD12,CD13,CD14,CD15,CD16,CD17,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD25,CD26,CD27,CD28,CD29,CD30,CD31,CD33,CD34,CD35,CD36,CD37,CD38,CD40,CD41,CD56,CD61,CD62,CD66,CD95,CD117,CD123,CD235,CD146,CD326,白介素-2受体(IL-2R),核因子κ B的受体激活剂(RANKL),SLAM-相关的蛋白(SAP),和TNFSF18(肿瘤坏死因子配体18或GITRL)。

在某些实施方案中,所述结合区以高亲和力结合靶标生物分子,所述靶标生物分子是选自下述的趋化因子受体:CXCR-1,CXCR-2,CXCR-3A,CXCR3B,CXCR-4,CXCR-5,CCR-I,CCR-2A,CCR-2B,CCR-3,CCR-4,CCR-5,CCR-6,CCR-7,CCR-8,CCR-9,CCR-10,CX3CR-1,XCR1,CXCR-6,CXCR-7,趋化因子结合蛋白-2(CCBP2,D6受体),和Duffy抗原/趋化因子受体(DARC,Fy糖蛋白,FY,CD234)。对于更多非限制性的靶标生物分子,参见下文实施例中的表11。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含含有SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸75-251或基本上由其组成的志贺毒素效应子区。其他实施方案是这样的蛋白,其中所述志贺毒素效应子区包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-241或基本上由其组成。其他实施方案是这样的蛋白,其中所述志贺毒素效应子区包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-251或基本上由其组成。其他实施方案是这样的蛋白,其中所述志贺毒素效应子区包含SLT-1A(SEQ ID NO:1)、StxA(SEQ ID NO:2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO:3)的氨基酸1-261或基本上由其组成。

在某些实施方案中,所述蛋白包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸269-508或基本上由其组成的免疫球蛋白型结合区,其展现特异性结合人CD38的高亲和力。其他实施方案是包含SEQ ID NOs:4-7所示的任一种多肽或基本上由其组成的蛋白。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸269-512或基本上由其组成的免疫球蛋白型结合区,其展现特异性结合人HER2的高亲和力。其他实施方案是包含SEQ ID NOs:8-11所示的任一种多肽或基本上由其组成的蛋白。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含含有SEQ ID NO:12的氨基酸269-516或基本上由其组成的免疫球蛋白型结合区,其展现特异性结合人CD19的高亲和力。其他实施方案是包含SEQ ID NOs:12-15所示的任一种多肽或基本上由其组成的蛋白。

在某些实施方案中,本发明的蛋白包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸269-518或基本上由其组成的免疫球蛋白型结合区,其展现特异性结合人CD74的高亲和力。其他实施方案是包含SEQ ID NOs:16-19所示的任一种多肽或基本上由其组成的蛋白。

在本发明的蛋白的实施方案中,所述结合区是展现特异性结合HER2的高亲和力的单结构域免疫球蛋白-来源区VHH,诸如来源于骆驼科抗体(VHH)蛋白5F7的单结构域可变区,如在美国专利申请公布2011/0059090中所述。在某些其他实施方案中,所述蛋白包含含有SEQ ID NO:20的氨墓酸268-385或基本上由其组成的免疫球蛋白型结合区,其展现特异性结合人HER2的高亲和力。其他实施方案是包含SEQ ID NOs:20-29所示的任一种多肽或基本上由其组成的蛋白。

在某些实施方案中,所述蛋白包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸269-365或基本上由其组成的免疫球蛋白型结合区,其展现特异性结合人CD2的高亲和力。其他实施方案是包含SEQ ID NOs:30-31所示的任一种多肽或基本上由其组成的蛋白。

如在本文中所使用的,术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别是指任何抗体VH或VL结构域(例如,人VH或VL结构域)及其至少保持相应天然抗体的定性抗原结合能力的任何衍生物(例如,源于天然鼠VH或VL结构域的人源化VH或VL结构域)。VH或VL,结构域由被三个CDRs或ABRs中断的“构架”区组成。构架区用于排列用于特异性结合抗原表位的CDRs。从氨基端到羧基端,VH和VL,结构域二者均包含以下构架(FR)和CDR区域:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。对于骆驼科VHH片段,软骨鱼的IgNARs,VNAR片段,以及它们的衍生物,存在包含相同的基本排列的单一重链可变结构域:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。

使用本发明的蛋白的多肽的片段、变体和/或衍生物也在本发明的范围内,其包含功能性细胞外靶标生物分子结合位点,并且甚至更优选地能够以高亲和力结合所述靶标生物分子(例如,由KD所示)。例如,尽管本发明提供了可以结合CD19、CD20、CD38、CD74和HER2的多肽序列,但是,任何包含以10-5至10-12摩尔/升、优选小于200nM的解离常数结合表达在细胞表面上的细胞外CD38或HER2的多肽的免疫球蛋白型结合区可以替代用于制备本发明的蛋白和用于本发明的五分时时彩方法。

在本发明某些实施方案中,免疫球蛋白型结合区来源于纳米抗体或单结构域免疫球蛋白来源的区域VHH。通常,纳米抗体由在骆驼科动物和软骨鱼类(Chondrichthyes)中发现的种类的天然存在的单一、单体可变结构域抗体(sdAbs)的片段构建。通过截短单一、单体可变结构域以产生较小和较稳定的分子,由这些天然存在的抗体改造出纳米抗体。由于它们的小尺寸,纳米抗体能够与不能接近整个抗体的抗原结合。在本发明某些实施方案中,免疫球蛋白型结合区来源于展现特异性结合人HER2蛋白的高亲和力的纳米抗体或单结构域免疫球蛋白来源的区域VHH。

III.本发明的蛋白的一般功能

本发明提供多种蛋白,每种蛋白包含:1)用于细胞靶向的免疫球蛋白型结合区,和2)细胞毒性的志贺毒素效应子区。细胞靶向性免疫球蛋白型结合区与志贺毒素亚基A来源的区域的连接能够允许改造有效的志贺毒素细胞毒性的细胞型特异性靶向。在某些实施方案中,本发明的蛋白能够结合与特性细胞型的细胞表面相关的细胞外靶标生物分子并进入这些细胞。一旦在被靶向的细胞型中内在化,本发明的蛋白的某些实施方案能够提供细胞毒性的志贺毒素效应子多肽片段进入靶细胞的细胞溶胶的路径。一旦在被靶向的细胞型的细胞溶胶中,本发明的细胞毒性蛋白的某些实施方案能够酶促失活核糖体,干扰细胞内稳态,并最终杀伤细胞。该系统是模块式的,原因在于可以使用任意数量的多样性的免疫球蛋白型结合区使该有效的细胞毒性或白细胞淤积靶向多种多样性的细胞型。备选地,本发明的蛋白的无毒变体可以用于将另外的外源物质递送到靶细胞内,诸如,或检测促进剂,以标记靶细胞内部,用于诊断信息收集功能。

A.通过靶向的志贺毒素细胞毒性的细胞杀伤

由于志贺毒素家族的成员适合杀伤真核细胞,因此,使用志贺毒素效应子区设计的细胞毒性蛋白可以表现出有效的细胞杀伤活性。志贺毒素家族的成员的A亚基包含能够在进入细胞的细胞溶胶中后杀伤真核细胞的酶结构域。本发明的细胞毒性蛋白的某些实施方案利用该细胞毒性机制,但是必须能够使志贺毒素效应子区进入被靶向的细胞型的细胞溶胶中。改造的方向可能通过经由志贺毒素效应子区天然所有的功能改善向细胞溶胶的递送而影响细胞毒性。

在本发明的细胞毒性蛋白的特定实施方案中,当与本发明细胞毒性蛋白的免疫球蛋白型结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞接触时,所述细胞毒性蛋白能够引起该细胞的死亡。在不同的靶细胞条件下,诸如离体操作的靶细胞、体外培养的靶细胞、在体外培养的组织样品内的靶细胞或体内靶细胞,使用本发明的细胞毒性蛋白可以实现细胞杀伤。

为了通过本发明的细胞毒性蛋白进行靶向的细胞杀伤,靶标生物分子的表达不需要是天然的。靶标生物分子的细胞表面表达可以是感染、存在病原体和/或存在细胞内微生物病原体的结果。靶标生物分子的表达可以是人工的,诸如,例如,在用病毒表达载体感染后通过迫使或诱导表达,参见,例如,腺病毒、腺伴随病毒和反转录病毒系统。靶标生物分子诱导表达的实例是暴露于类视黄醇(如全反视黄酸和各种合成的类视黄醇)或任意视黄酸受体(RAR)激动剂的细胞的CD38表达的上调(Drach J等,Cancer Res 54:1746-52(1994);Uruno A等,J Leukoc Biol 90:235-47(2011))。在另一个实例中,可以通过使细胞暴露于电离辐射而诱导CD20、HER2和EGFR表达(Wattenberg M等,Br J Cancer 110:1472-80(2014))。

B.在多种细胞型之间的选择性细胞毒性

通过利用高亲和性免疫球蛋白型结合区使酶活性志贺毒素区的递送靶向特定细胞类型,该有效的细胞杀伤活性可以限制为优先杀伤所选择的细胞型。本发明提供多种具有这种功能能力的细胞毒性蛋白。

在某些实施方案中,在将本发明的细胞毒性蛋白施用给细胞型的混合物后,所述细胞毒性蛋白能够相对于没有与细胞外靶标生物分子物理连接的细胞类型选择性地杀死与特定细胞外靶标生物分子物理连接的那些细胞。因为志贺毒素家族的多个成员适合用于杀伤真核细胞,使用志贺毒素效应子区设计的细胞毒性蛋白可以显示出有效的细胞毒性活性。通过使用高亲和力结合区域将酶活性的志贺毒素区域的递送靶向特定细胞类型,该有效的细胞杀伤活性可以限于仅优先杀死希望通过它们与被选择的结合区特异性结合的靶标生物分子的物理结合而靶向的那些细胞型。

在某些实施方案中,本发明的细胞毒性蛋白能够选择性地或优先地造成两个或更多个不同细胞型的混合物内的特定细胞型的死亡。这能够实现与不表达靶标生物分子的“旁观”细胞类型相比高优先的对特定细胞类型的细胞毒性活性靶向,诸如3倍细胞毒性效应。备选地,如果靶标生物分子以足够低的量表达和/或以低量与不靶向的细胞型物理连接,则结合区的靶标生物分子的表达可以不专属于一种细胞类型。这允许相对于不表达显著量的靶标生物分子或不与显著量的靶标生物分子物理连接的“旁观”细胞类型以高优先性(诸如3-倍的细胞毒性作用)进行特定细胞类型的靶向性细胞杀伤。

细胞表面上细胞外靶标生物分子的水平可以使用本领域技术人员已知的多种五分时时彩方法确定,诸如例如,FACS法。用于本文时,通过FACS分析,在细胞表面上表达的显著量的细胞外靶标生物分子大于10,000,20,000,30,000,40,000,50,000,60,000,或70,000平均荧光强度(MFI),这取决于细胞类型。

在某些其它实施方案中,在将细胞毒性蛋白施用给两个关于细胞外靶标生物分子的存在和/或多肽序列不同的细胞型群体后,细胞毒性蛋白能够造成细胞死亡,如通过关于靶细胞群体(其成员表达细胞毒性蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子)的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所确定的,例如,其剂量比相同细胞毒性蛋白对于其成员不表达细胞毒性蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子的细胞群体的CD50剂量低至少3倍。

在某些实施方案中,本发明的蛋白对与细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的群体的细胞毒性活性比对没有与本发明的蛋白特异性结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型群体的细胞毒性活性至少3倍高。根据本发明,可以以下述比率(a/b)的方式定量选择性的细胞毒性:(a)对与结合区的靶标生物分子物理连接的特定细胞型的细胞群体的细胞毒性:(b)对没有与结合区的靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中,所述细胞毒性比率指示,相对于没有与结合区的靶标生物分子物理连接的细胞群体或细胞型,对与结合区的靶标生物分子物理连接的细胞群体或细胞型的选择性的细胞毒性至少3倍高、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍。

该优先细胞杀伤功能允许本发明的某些细胞毒性蛋白在不同条件下和在有非靶向的旁观细胞(诸如离体操作的细胞型的混合物、体外培养的含有细胞型混合物的组织)存在下、或在体内在有多个细胞型存在下(例如原位或在多细胞生物体内的天然位置)杀伤被靶向的细胞。

在某些实施方案中,本发明的蛋白能够选择性地或优先地造成两个或更多个不同细胞型的混合物内的特定细胞型的死亡。这能够实现与不表达被本发明的细胞毒性蛋白的结合区特异性结合的细胞外靶标的“旁观”细胞类型相比高优先的对特定细胞类型的靶向细胞毒性活性,诸如3倍细胞毒性效应。备选地,如果细胞外靶标生物分子以足够低的量被不靶向的细胞型表达,则细胞外靶标生物分子的表达可以不专属于一种细胞类型。这允许相对于不表达显著量的被所述细胞毒性蛋白特异性结合的靶标生物分子和/或不与显著量的被所述细胞毒性蛋白特异性结合的细胞外暴露的靶标生物分子物理连接的“旁观”细胞类型仅对表达最高量的细胞外靶标生物分子的那些细胞型的优先的细胞杀伤杀伤(诸如3-倍的细胞毒性作用)。

本发明的细胞毒性蛋白可用于消除特定细胞型群体。例如,本发明的细胞毒性蛋白可用于通过消除在一个或多个细胞表面表达升高水平的靶标生物分子的“靶标生物分子+”细胞而治疗某些肿瘤、癌症和/或其他生长异常。

在某些实施方案中,本发明的蛋白针对于特定细胞外靶标生物分子物理连接的细胞群体的细胞毒性活性比对没有与显著量的被本发明的特定蛋白的结合区特异性结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型群体的细胞毒性活性至少3倍高。根据本发明,可以以下述比率(a/b)的方式定量选择性的细胞毒性:(a)对与显著量的被本发明的细胞毒性蛋白结合区结合的靶标生物分子物理连接的细胞群体的细胞毒性:(b)对没有与显著量的被本发明所述细胞毒性蛋白的结合区特异性结合的任何细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中,所述细胞毒性比率指示,相对于部表达细胞外靶标生物分子或没有与显著量的被本发明的特定细胞毒性蛋白的结合区特异性结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞群体或细胞型,对表达细胞外靶标生物分子或与被本发明的细胞毒性蛋白的结合区结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞群体或细胞型的选择性的细胞毒性至少3倍高、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍或更高。例如,在将本发明的某些细胞毒性蛋白施用给两个关于细胞外靶标生物分子的存在和/或多肽序列不同的不同细胞型群体后,本发明的细胞毒性蛋白能够造成与被所述细胞毒性蛋白的结合区结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的细胞死亡,例如,与没有与被细胞毒性蛋白的结合区结合的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的结合的CD50或与仅与包含破坏所述细胞毒性蛋白的结合区的结合特异性的序列变异或突变的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞型的结合的CD50相比,其CD50是至少3倍或更低。

在本发明的细胞毒性蛋白的某些实施方案中,在将细胞毒性蛋白施用给两个不同的细胞型群体后,细胞毒性蛋白能够造成细胞死亡,如通过关于第一细胞群体(其成员在细胞表面表达特定细胞外靶标生物分子)的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所确定的,其剂量比相同细胞毒性蛋白对于其成员不表达靶标生物分子、不表达显著量的靶标生物分子、或不暴露被所述细胞毒性蛋白的结合区结合的靶标生物分子的第二细胞群体的CD50剂量低至少3倍。

C.另外的外源物质向靶细胞内部的递送

除了直接的细胞杀伤以外,本发明的蛋白任选地可以用于将另外的外源物质递送至靶细胞内部。另外的外源物质的递送可以用于,流入,细胞抑制、信息收集和/或诊断功能。本发明的细胞毒性蛋白的无毒变体、或任选地毒性变体,可以利用与将另外的外源物质递送至于本发明的蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞和/或标记所述细胞的内部。在至少一个细胞表面表达靶标生物分子的多种细胞型和/或细胞群体可以被本发明的蛋白靶向,用于接受外源物质。本发明的功能组分是模块式的,原因在于多种志贺毒素效应子区和另外的外源物质可以与多种结合区连接,以提供多样性的应用,诸如肿瘤细胞的非侵入性体内成像。

因为本发明的蛋白(不管是其有毒还是无毒的及没有催化活性的形式)能够进入与细胞外靶标生物分子(其被本发明的蛋白的结合区识别)物理连接的细胞中,本发明的蛋白的某些实施方案可以用于将另外的外源物质递送进被靶向的细胞型的内部。在一个意义上,本发明的整个蛋白是进入细胞的外源物质;因而,“另外的”外源物质是与核心蛋白本身连接、但是除此以外的异源物质。

本文中使用的“另外的外源物质”表示一个或多个分子,其经常是通常不存在于天然靶细胞内,其中本发明的蛋白可以用于特异性地将这样的物质运输至细胞内部。另外的外源物质的非限制性例子是细胞毒性试剂、肽、多肽、蛋白、多核苷酸、检测促进剂和小分子化学治疗剂。

在本发明用于递送另外的外源物质的蛋白的某些实施方案中,所述另外的外源物质是细胞毒性试剂,诸如,例如,小分子化学治疗剂,细胞毒性抗生素、烷基化试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。细胞毒性试剂的非限制性实例包括氮丙啶(aziridines),顺铂(cisplatins),四嗪(tetrazines),丙卡巴肼(procarbazine),六甲蜜胺(hexamethylmelamine),长春花生物碱(vinca alkaloids),紫杉烷(taxanes),喜树碱(camptothecins),依托泊苷(etoposide),多柔比星(doxorubicin),米托蒽醌(mitoxantrone),替尼泊苷(teniposide),新生霉素(novobiocin),阿柔比星(aclarubicin),蒽环类抗生素(anthracyclines),放线菌素(actinomycin),博来霉素(bleomycin),普利霉素(plicamycin),丝裂霉素(mitomycin),柔红霉素(daunorubicin),表柔比星(epirubicin),伊达比星(idarubicin),多拉司他汀(dolastatins),美坦辛(maytansines),多西他赛(docetaxel),阿霉素(adriamycin),加利车霉素(calicheamicin),阿里他汀(auristatins),吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine),卡铂(carboplatin),5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU),卡培他滨(capecitabine),丝裂霉素C(mitomycin C),紫杉酚(paclitaxel),1,3-二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU),利福平(rifampicin),顺铂(cisplatin),甲氨蝶呤(methotrexate)和吉西他滨(gemcitabine)。

在某些实施方案中,所述另外的外源物质包含含有酶的蛋白或多肽。在某些其它实施方案中,所述另外的外源物质是核酸,例如,作为小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些实施方案中,所述另外的外源物质是抗原,诸如从细菌蛋白、病毒蛋白、在癌症中突变的蛋白、在癌症中异常表达的蛋白、或T-细胞互补决定区来源的抗原。例如,外源物质包括抗原,诸如被细菌感染的抗原呈递细胞特有的那些抗原,和能够作为外源抗原起作用的T-细胞互补决定区。

D.用于诊断功能的信息收集

本发明的某些蛋白用在特定细胞、细胞型和/或细胞群体的体外和/或体内检测中。在某些实施方案中,本文描述的细胞毒性蛋白用于诊断和治疗二者,或仅用于诊断。当相同细胞毒性蛋白用于诊断和治疗二者时,通过一个或多个氨基酸置换(包括本文描述的示例性置换)对志贺毒素效应子区的催化灭活,可以使包含用于诊断的检测促进剂的细胞毒性蛋白变体无毒。与检测促进剂缀合的、本发明的细胞毒性蛋白的无毒形式任选地可以用于诊断功能,诸如用于与包含相同或相关结合区域的治疗方案联合使用的伴侣诊断。

将本领域已知的检测促进剂与本发明的各种蛋白缀合的能力会提供用于检测癌症、肿瘤、免疫和被感染的细胞的有用组合物。通过本领域已知的各种成像技术和测定,本发明的蛋白的这些诊断实施方案可以用于信息收集。例如,通过患者或活组织检查样品中各个癌细胞、免疫细胞或受感染的细胞的细胞内细胞器(例如内吞区室、高尔基区室、内质网区室和细胞溶质区室)的成像,本发明的蛋白的诊断实施方案可以用于信息收集。

使用本发明的蛋白的诊断实施方案可以收集不同类型的信息,无论用于诊断用途还是其它用途。该信息可用于,例如,诊断赘生性细胞类型,确定患者的疾病的治疗敏感性,测定抗肿瘤治疗随时间的进展,测定免疫调节治疗随时间的进展,测定抗微生物治疗随时间的进展,评价受感染的细胞在移植物中的存在,评价不希望的细胞类型在移植物中的存在,和/或评价肿瘤块的外科手术切除以后残余肿瘤细胞的存在。

例如,使用用本发明的蛋白的诊断变体收集的信息,可能确定患者亚群,然后可以基于使用那些诊断实施方案揭示的他们的独特特征将各个患者分类成亚群。例如,特定药物或治疗的有效性可能是用于定义患者亚群的一类判据。例如,可以使用本发明的特定细胞毒性蛋白的无毒诊断变体区分哪些患者属于预期对本发明的相同蛋白的细胞毒性变体做出阳性应答的患者的类别或亚群。因此,使用本发明的蛋白和/或它们的无毒变体进行患者鉴别、患者分级和诊断的有关五分时时彩方法被认为是在本发明范围内。

IV.保持整体结构和功能的本发明蛋白的多肽序列中的变异

技术人员会认识到,可以对本发明的蛋白(和编码其的多核苷酸)做出变化,而不减少它们的生物活性,例如,通过维持本发明的蛋白的整体结构和功能。例如,有些修饰可以促进表达、纯化、药代动力学性能和/或免疫原性。这样的修饰是技术人员众所周知的,且包括,例如,将甲硫氨酸添加在氨基端以提供起始位点,将另外的氨基酸放置在任一端上以产生方便地定位的限制位点或终止密码子,和使生化亲和标签与任一端融合以提供方便的检测和/或纯化。

在本文中还预见到在氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸残基,诸如表位标签或其它结构部分的序列。所述另外的氨基酸残基可以用于多种目的,包括,例如,促进克隆、表达、翻译后修饰、合成、纯化,检测和施用。表位标签和结构部分的非限制性例子是:壳多糖(chitin)结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、因子Xa切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶结构部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、聚组氨酸标签、ReAsH标签、strep-标签、strep-标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和V5表位标签。

在某些以上实施方案中,本发明的蛋白是存在引入多肽区中的一个或多个保守氨基酸置换的变体。本文中使用的术语“保守置换”表示,一个或多个氨基酸被另一个生物学上相似的氨基酸残基替换。例子包括具有相似特征的氨基酸残基(例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的置换(参见,例如,下表B)。使用通常不存在于内源哺乳动物肽和蛋白中的残基的保守置换的一个例子是利用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于与肽和蛋白中表型上沉默的置换相关的其它信息,参见,例如,Bowie J等,Science 247:1306-10(1990)。

在下表B的保守置换方案中,示例性的保守氨基酸置换根据物理化学性质进行分组——I:中性的、亲水的;II:酸和酰胺;III:碱性的;IV:疏水的;V:芳族的、庞大氨基酸,VI亲水的、不带电荷的,VII脂族不带电荷的,VIII非极性的不带电荷的,IX环烯基相关的、X疏水的,XI极性的,XII小的,XIII允许旋转的,和XIV柔性的。例如,保守氨基酸置换包括以下的:1)S可以置换C;2)M或L可以置换F;3)Y可以置换M;4)Q或E可以置换K;5)N或Q可以置换H;和6)H可以置换N。

表B.保守氨基酸置换的实例

在某些实施方案中,本发明的蛋白可以包含本发明的多肽区域的功能片段或变体,与本文引用的多肽序列相比,所述功能片段或变体最多具有20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换,只要被置换的多肽区域单独地或作为本发明的蛋白的组分保留可测量的生物学活性即可。作为通过下述改变本发明的蛋白的多肽的结果,本发明的蛋白的变体是在本发明范围内:改变一个或多个氨基酸或删除或插入一个或多个氨基酸(诸如在免疫球蛋白型结合区或志贺毒素效应子区内),以便实现期望的性能,诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。本发明的蛋白的多肽还可以具有或没有信号序列。

在某些实施方案中,本发明的蛋白与本文引用的蛋白的氨基酸序列中的任一个具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列,只要其保持可测量的生物活性如细胞毒性、细胞外靶标生物分子结合、酶催化、或亚细胞按路线发送即可。免疫球蛋白型结合区可以与在本文中叙述的蛋白的氨基酸序列不同,只要其保持与其细胞外靶标生物分子的结合功能即可。如果CDRs或ABRs的氨基酸序列相同,则将最有可能保持结合功能。例如,在权利要求范围内的是包含与本文所述的蛋白具有85%氨基酸同一性或基本上由其组成的蛋白,其中出于确定氨基酸同一性程度的目的而忽略形成CDRs或ABRs的氨基酸残基。结合功能可以由技术人员使用标准技术测定。

在某些实施方案中,可以改变志贺毒素效应子区以改变其酶活性和/或细胞毒性,只要所述志贺毒素效应子区保留抑制或多种另外的志贺毒素效应子功能。这种改变可以或可以不引起改变的志贺毒素效应子区是其中的组分的蛋白的细胞毒性的改变。可能的改变包括志贺毒素效应子区的选自由下列各项组成的组的突变:截短、缺失、倒置、插入、重排和置换。

可以通过突变或截短来改变、减少或消除志贺毒素家族成员的A亚基的细胞毒性。已经证明标记为酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114、和色氨酸-203的位置对于Stx、Stx1、和Stx2的催化活性是重要的(Hovde C等,Proc Natl Acad Sci USA 85:2568-72(1988);Deresiewicz R等,Biochemistry 31:3272-80(1992);Deresiewicz R等,Mol Gen Genet 241:467-73(1993);Ohmura M等,Microb Pathog 15:169-76(1993);Cao C等,Microbiol Immunol 38:441-7(1994);Suhan M,Hovde C,Infect Immun 66:5252-9(1998))。在无细胞核糖体失活测定中将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变消除了Slt-I A1的酶活性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。在利用内质网中Slt-I A1的从头表达的另一种五分时时彩方法中,将谷氨酸-167和精氨酸-170二者突变在所述表达水平上消除了Slt-I A1片段细胞毒性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短分析表明,残基75至268的StxA的片段在体外仍然保持明显的酶活性(Haddad,J Bacteriol 175:4970-8(1993))。通过细胞溶胶中的从头表达,含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段显示出明显的体外酶活性和细胞毒性(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达不是细胞毒性的,因为其不能逆移位到细胞溶胶中(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。

志贺毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性最重要的残基被绘图定位至以下残基位置:特别是天冬酰胺-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、和精氨酸-176(Di,Toxicon 57:535-39(2011))。尤其是,含有谷氨酸-E167到赖氨酸和精氨酸-176到赖氨酸突变的Stx2A的双突变构建体完全失活;而Stx1和Stx2中的许多单一突变显示出细胞毒性的10倍降低。此外,截短Stx1A至1-239或1-240降低了其细胞毒性,并且类似地,截短Stx2A至保守疏水残基降低了其细胞毒性。

志贺毒素A亚基中对结合真核核糖体和/或真核核糖体抑制最重要的残基被绘图定位至以下残基位置:特别是精氨酸-172、精氨酸-176、精氨酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、缬氨酸-191和亮氨酸-233(McCluskey A等,PLoS One 7:e31191(2012)。

志贺样毒素1A亚基截短是具有催化活性的,能够在体外使核糖体酶促失活,并且当在细胞内表达时是具有细胞毒性的(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。展现出完全酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。尽管报道的保持基本催化活性的志贺毒素A亚基的最小片段是StxA的残基75-247(Al-Jaufy,Infect Immun 62:956-60(1994)),在真核细胞内从头表达的StxA截短仅需要至多残基240以到达细胞溶胶并且进行核糖体的催化失活(LaPointe,J Biol Chem 280:23310-18(2005))。

在来源于SLT-1A(SEQ ID NO:1)或StxA(SEQ ID NO:2)的某些实施方案中,这些改变包括位置75处的天冬酰胺、位置77处的酪氨酸、位置114处的酪氨酸、位置167处的天冬氨酸、位置170处的精氨酸、位置176处的精氨酸的置换,和/或位置203处的色氨酸的置换。对于技术人员来说,基于现有技术,这种置换的实例将会是已知的,如位置75处的天冬酰胺变为丙氨酸、位置77处的酪氨酸变为丝氨酸、位置114处的酪氨酸变为丝氨酸的置换、位置167处的谷氨酰胺变为天冬氨酸的置换、位置170处的精氨酸变为丙氨酸的置换、位置176处的精氨酸变为赖氨酸的置换、和/或位置203处的色氨酸变为丙氨酸的置换。

本发明的蛋白可以任选地与一种或多种另外的药剂缀合,所述另外的药剂可以包括本领域中已知的治疗剂和/或诊断剂,包括本文所述的此类试剂。

V.本发明的蛋白的生产、制造和纯化

本发明的蛋白可以使用对本领域技术人员来说公知的生物化学工程技术生产。例如,本发明的细胞毒性蛋白可以通过标准合成五分时时彩方法、利用重组表达系统生产,或者通过任何其他适合的五分时时彩方法生产。本发明的蛋白可以作为融合蛋白、化学连接的缀合物和/或它们的组合(例如,与一种或多种组分共价连接的融合蛋白组分)生产。因此,本发明的蛋白可以以多种方式合成,包括,例如包括下列各项的五分时时彩方法:(1)使用标准固相或液相五分时时彩方法、分步地或通过片段组装来合成本发明的蛋白的多肽或多肽组分,并且将最终的肽化合物产物分离并纯化;(2)在宿主细胞中表达编码本发明的蛋白的多肽或多肽组分的多核苷酸并且从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物;或(3)进行编码本发明的蛋白的多肽或多肽组分的多核苷酸的无细胞体外表达,并且回收表达产物;或者通过五分时时彩方法(1)、(2)或(3)的任意组合以获得肽组分的片段,随后将片段结合(例如连接(ligating))以获得肽组分,并且回收肽组分。

可以优选通过固相或液相肽合成来合成本发明的蛋白的多肽或多肽组分。本发明的蛋白可以适合地通过标准合成五分时时彩方法生产。因此,可以通过例如这样的五分时时彩方法来合成肽,所述五分时时彩方法包括通过标准固相或液相五分时时彩方法、分步地或通过片段组装来合成肽,并且将最终的肽产物分离并纯化。在该情形中,可以参考WO 1998/11125,或尤其是Fields G等,Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis(Synthetic Peptides,Grant G,ed.,Oxford University Press,U.K.,第2版,2002)以及其中的合成实例。

本发明的蛋白可以使用在本领域内公知的重组技术制备(生产和纯化)。通常,通过培养转化或转染有包含编码多核苷酸的载体的宿主细胞并且从细胞培养物中回收多肽来制备多肽的五分时时彩方法被描述于,例如Sambrook J等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY,U.S.,1989);Dieffenbach C等,PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.,U.S.,1995)。任何适合的宿主细胞均可以用于生产本发明的蛋白。宿主细胞可以是用一种或多种驱动本发明的多肽表达的表达载体稳定或瞬时转染、转化、转导或感染的细胞。此外,可以通过修饰编码本发明的蛋白的多核苷酸来生产本发明的蛋白,这导致改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入一个或多个氨基酸,以便实现所需性质,如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。

存在宽泛种类的可以选择用于生产本发明的蛋白的表达系统。例如,用于表达本发明的蛋白的宿主生物体包括原核生物,诸如大肠杆菌和芽胞枯草杆菌(B.subtilis),真核细胞,诸如酵母和丝状真菌(如酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)),藻类(如衣藻(C.reinhardtii)),昆虫细胞系,哺乳动物细胞(如CHO细胞),植物细胞系,和真核生物体,如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)和本生烟草(N.benthamiana))。

因此,本发明还提供用于根据以上所述五分时时彩方法并且使用下述来生产本发明的蛋白的五分时时彩方法:(i)编码本发明的蛋白或其多肽组分的部分或全部的多核苷酸,(ii)包含当被引入到适当的宿主细胞中或不含细胞的表达系统中时能够编码本发明的蛋白或其多肽组分的部分或全部的本发明的至少一种多核苷酸的表达载体,和/或(iii)包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。

当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达多肽或蛋白时,有利的是从其他组分如宿主细胞因子中分离(或纯化)所需的多肽或蛋白,从而获得高纯度的或基本均质的制剂。纯化可以通过在本领域内公知的五分时时彩方法完成,如离心技术,提取技术,层析和分馏技术(例如,通过凝胶过滤的尺寸分离、通过离子交换柱的电荷分离、疏水相互作用层析法、反相层析法、在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE等上的层析法、层析聚焦、和蛋白A琼脂糖层析法,以用于去除污染物),以及沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀。任何数量的生物化学纯化技术均可以用于增加本发明的蛋白的纯度。在某些实施方案中,本发明的蛋白可以任选地以同型多聚体形式(即,两个以上相同蛋白的蛋白复合物)或异型多聚体形式(即,两个以上不同的蛋白的蛋白复合物)纯化。

在以下实施例中的是对用于生产本发明的蛋白的五分时时彩方法的非限制性实例的描述,以及公开的示例性细胞毒性蛋白的蛋白制备的具体但非限制性的方面。

VI.包含本发明的蛋白的药物和诊断组合物

本发明提供这样的蛋白,其用于单独地或在药物组合物中与一种或多种另外的治疗剂组合地用于治疗或预防以下更详细描述的病患、疾病、病症、或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染)。本发明还提供药物组合物,其包含本发明的蛋白或其根据本发明的药用盐或溶剂化物,以及至少一种药用载体、赋形剂、或载体。在某些实施方案中,本发明的药物组合物可以包含本发明的蛋白的同型多聚体和/或异型多聚体形式。所述药物组合物将可用于治疗、改善、或预防以下更详细描述的疾病、病患、病症、或症状的五分时时彩方法。预期各个这样的疾病、病患、病症、或症状均为就本发明所述的药物组合物的用途而言的单独的实施方案。本发明还提供用于至少一种如以下更详细描述的本发明所述的治疗五分时时彩方法的药物组合物。

如在本文中所使用的,术语“患者”和“受试者”可互换使用,以指代任何生物,通常是脊椎动物如人和动物,其表现出至少一种疾病、病症、或病患的症状、征兆、和/或指征。这些术语包括哺乳动物如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、宠物(例如猫、狗等)以及实验动物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性实例。

如在本文中所使用的,“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”以及它们的语法变体是指用于获得有益或所需的临床结果的五分时时彩方法。该术语可以指延缓病患、病症或疾病的发病或发展速度,减轻或缓解与其有关的症状,产生病患的全部或部分消退,或者以上任何的一些组合。对于本发明的目的来说,有益或所需的临床结果包括,但不限于,无论是否是可检测的或不可检测的,症状的减轻或缓解、疾病程度降低、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病发展的推迟或延缓、疾病状态的改善或缓和、以及康复(无论是部分的或全部的)。“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”还可以意指相对于在不接受治疗的情况下的预期存活时间延长存活。需要治疗的受试者(例如人)因此可以是已经遭受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、或“治疗(treatment)”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理状态或症状的严重性的增加,并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病患完全停止。关于肿瘤和/或癌症,治疗包括整体肿瘤负担和/或个体肿瘤尺寸的减小。

如在本文中所使用的,术语“防止(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”以及它们的语法变体是指用于预防病患、疾病、或病症的发展或者改变病患、疾病、或病症的病理学的五分时时彩方法。因此,“预防”可以指预防或防止的措施。对于本发明的目的来说,有益或所需的临床结果包括,但不限于,无论是否是可检测的或不可检测的,预防或延缓疾病的症状、进展或发展。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未遭受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况延缓疾病的发病,并且并非必须意指暗示相关疾病、病症、或病患的永久性预防。因此在某些情形中病患的“预防(preventing)”或“预防(prevention)”可以是指降低发展病患的风险,或者预防或推迟与该病患有关的症状的发展。

如在本文中所使用的,“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种所需治疗效果的组合物(例如治疗组合物或药剂)的量或剂量,如预防或治疗目标病患或有益地缓解与该病患有关的症状。最合乎需要的治疗有效量是将会产生由本领域技术人员为需要其的给定受试者选择的具体治疗的所需功效的量。这种量将会根据各种技术人员理解的因素变化,包括但不限于,治疗性化合物的特性(包括活性、药物动力学、药效学、和生物利用度),受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、总体身体状况、对给定剂量的响应性、和药物的类型),药用载体或制剂中载体的性质,以及给药途径。临床和药理学技术的人员将能够通过常规实验确定治疗有效量,即通过监测受试者对施用化合物的响应并且相应地调节剂量(参见,例如,Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro A,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,U.S.,第19版,1995))。

本发明的诊断组合物包含本发明的蛋白和一个或多个检测促进剂。各种检测促进剂是本领域已知的,诸如同位素、染料、比色测量剂、反差增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性剂。这些试剂可以在任何位置掺入本发明的蛋白中。所述试剂的掺入可以是通过本发明的蛋白的氨基酸残基或通过本领域已知的一些连接类型,包括通过接头和/或螯合剂。所述试剂的掺入是以这样的方式:能够在筛选、测定、诊断操作和/或成像技术中检测诊断组合物的存在。

当生产或制备本发明的诊断组合物时,本发明的蛋白可以直接地或间接地连接至一个或多个检测促进剂。存在技术人员已知的众多检测促进剂,它们可以可操作地连接至本发明的蛋白用于信息收集五分时时彩方法,诸如用于针对生物体的疾病、病症或病患的诊断和/或预后应用(参见例如Cai W等,J Nucl Med 48:304-10(2007);Nayak T,Brechbiel M,Bioconjug Chem 20:825-41(2009);Paudyal P等,Oncol Rep 22:115-9(2009);Qiao J等,PLoS ONE 6:e18103(2011);Sano K等,Breast Cancer Res 14:R61(2012))。例如,检测促进剂包括增强图像的造影剂,诸如荧光染料(例如Alexa680、吲哚菁绿和Cy5.5)、同位素和放射性核素,诸如11C、13N、15O、18F、32p、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86y、90y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re和223R,顺磁离子,诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III),金属,诸如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III),超声-反差增强剂,诸如脂质体,不透射线的试剂,诸如钡、镓和铊化合物。通过使用中间官能团,诸如螯合剂如2-苄基DTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA、其类似物和前述任一种的功能等同物(参见Leyton J等,Clin Cancer Res 14:7488-96(2008)),可以直接地或间接地掺入检测促进剂。

存在技术人员已知的用于将各种检测促进剂掺入、附着和/或缀合至蛋白、特别是免疫球蛋白和免疫球蛋白来源的结构域的众多标准技术(Wu A,Methods 65:139-47(2014))。类似地,存在技术人员已知的众多成像方案,诸如在医学领域中常用的非侵入性体内成像技术,例如:计算机体层摄影术成像(CT扫描)、光学成像(包括直接的、荧光的和生物发光的成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声和x-射线计算机体层摄影术成像(关于综述,参见Kaur S等,Cancer Lett 315:97-111(2012))。

生产或制备包含本发明的蛋白的药物和/或诊断组合物

任何本发明的蛋白的药用盐或溶剂化物同样也在本发明的范围内。

本发明情形中的术语“溶剂化物”是指在溶质(在本情况下,为根据本发明的多肽化合物或其药用盐)和溶剂之间形成的限定的化学计量的复合物。相关的溶剂可以是,例如,水、乙醇或另一种药用的、通常为小分子有机物种,如,但不限于,乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时,这种溶剂化物通常被称为水合物。

本发明的蛋白或其盐可以被配制为为储存或施用而制备的药物组合物,所述药物组合物通常包含在药用载体中的治疗有效量的本发明的化合物或其盐。术语“药用载体”包括任何标准药物载体。用于治疗用途的药用载体是制药领域中公知的,并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro,编,1985)。如在本文中所使用的,“药用载体”包括任何和所有生理学上可接受的,即相容的,溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂、等渗剂、和吸收延缓剂等。药用载体或稀释剂包括在适用于口服、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、和经皮)施用的制剂中使用的那些。示例性的药用载体包括无菌水溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的即时制备的无菌粉末。可以在本发明的药物组合物中采用的适合的水性和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它们的适合的混合物,植物油如橄榄油,以及可注射有机酯如油酸乙酯。例如,通过使用包衣材料如卵磷脂,通过维持分散液情况下所需的粒度,以及通过使用表面活性剂,可以维持适当的流动性。在某些实施方案中,载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据所选择的给药途径,可以将本发明的蛋白或其他药物组分包衣在用于保护化合物免受当通过特定给药途径施用于患者时本发明的活性蛋白可能会遇到的低pH和其他天然失活条件的作用影响的物质中。

本发明的药物组合物的制剂可以以单位剂型方便地提供并且可以通过任何在药学领域内公知的五分时时彩方法制备。以这种形式,将组合物分为含有适合量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂,包装含有离散量的制剂,例如,小包片剂、胶囊、和小药瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊、扁胶囊(cachet)、或片剂本身,或者其可以是适合数量的这些包装形式中的任何一种。其可以以单剂量可注射形式,例如以笔(pen)的形式提供。可以将组合物配制为用于任何适合的施用途径和方式。皮下或经皮施用方式可以特别适用于在本文中所描述的治疗性蛋白。

本发明的药物组合物还可以含有辅助剂,如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作,以及通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等,可以确保防止存在微生物。组合物中的等渗剂,如糖类、氯化钠等,也可以是合乎需要的。此外,通过包含延缓吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶,可以产生可注射药物形式的延长的吸收。

本发明的药物组合物还任选地包含药用抗氧化剂。示例性的药用抗氧化剂是:水溶性抗氧化剂如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等;油溶性抗氧化剂,如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等;以及金属螯合剂,如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

在另一个方面中,本发明提供药物组合物,其包含本发明的不同的蛋白或任何前述各项的酯、盐或酰胺中的一种或组合,以及至少一种药用载体。

治疗性组合物在制造和储存条件下通常是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其他规则结构。载体可以是溶剂或分散介质,包括,例如,水、醇如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、或任何适合的混合物。例如,通过使用包衣如卵磷脂,在分散体的情况下通过维持所需的粒度,以及通过使用表面活性剂,根据本领域内公知的制剂化学,可以维持适当的流动性。在某些实施方案中,等渗剂,例如糖类,多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇,或氯化钠可以是在组合物中合乎需要的。可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来产生可注射组合物的延长吸收。

用于皮内或皮下施用的溶液或悬浮液通常包括下列各项中的一种或多种:无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非发挥性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂如乙二胺四乙酸;缓冲液如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;以及张力(tonicitv)调节剂如,例如,氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱,如盐酸或氢氧化钠,或者具有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。此类制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小药瓶中。

通过以所需的量将本发明的蛋白以及上述成分中的一种或组合加入适合的溶剂中,当需要时,继之以进行灭菌微过滤,可以制备无菌可注射溶液。通过将活性化合物加入至含有分散介质和其他成分(如上述那些)的无菌赋型剂中,可以制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下,制备五分时时彩方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干),其产生活性成分以及来自其无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。

当将治疗有效量的本发明的蛋白设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时,粘合剂将会是无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。考虑到适合的pH、等渗性、稳定性等,用于制备肠胃外可接受的蛋白质溶液的五分时时彩方法属于本领域技术。除了粘合剂之外,用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选的药物组合物将含有等渗赋型剂,如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer′s injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液、或在本领域中已知的其他赋型剂。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂、或对本领域技术人员来说公知的其他添加剂。

如在本文中其他地方描述的,本发明的蛋白或其组合物(例如,药物或诊断组合物)可以用保护组合物免于快速释放的载体来制备,如受控释放制剂,包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。许多用于制备这种制剂的五分时时彩方法被授予了专利或是本领域技术人员通常已知的(参见,例如,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(Robinson J,ed.,Marcel Dekker,Inc.,NY,U.S.,1978))。

在某些实施方案中,可以将本发明的组合物(例如,药物或诊断组合物)配制成确保在体内的所需分布。例如,血脑屏障排除许多大型和/或亲水性化合物。为了将本发明的治疗性化合物或组合物靶向至特定的体内位置,例如,可以将它们配制在可以包含被选择性地运输至特定细胞或器官的一个或多个结构部分的脂质体中,从而增强靶向药物递送。示例性的靶向结构部分包括叶酸或生物素;甘露糖苷;抗体;表面活性剂蛋白A受体;p120联蛋白等。

药物组合物包括被设计成用作植入物或微粒系统的胃肠外制剂。植入物的例子是由聚合的或疏水的组分(诸如乳剂、离子交换树脂和可溶性的盐溶液)组成的贮库制剂。微粒系统的例子是树枝状大分子(dendrimers)、脂质体、微球、微粒、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米棒、纳米球、聚合胶束和纳米管(参见例如Honda M等,Int J Nanomedicine 8:495-503(2013);Sharma A等,Biomed Res Int 2013:960821(2013);Ramishetti S,Huang L,Ther Deliv 3:1429-45(2012))。使用对离子敏感的聚合物,诸如,例如,脂质体、泊洛沙姆407和羟磷灰石,可以制备控释制剂。颗粒和聚合物制剂可以包含改变浆膜渗透性是试剂,诸如,例如,各种肽和蛋白,如溶细胞素,毒素来源的试剂,病毒来源的试剂,合成的生物模拟肽,和化学试剂(参见,例如,Varkouhi等,J Control Release 151:220-8(2011);J Pirie C等,Mol Cancer Ther 12:1774-82(2013))。

VII.多核苷酸、表达载体和宿主细胞

除了本发明的蛋白以外,编码这种蛋白或其功能部分的多核苷酸也在本发明的范围内。术语“多核苷酸”是术语“核酸”的等同物,二者均包括脱氧核糖核酸(DNAs)的聚合物、核糖核酸(RNAs)的聚合物、利用核苷酸类似物产生的这些DNA或RNA的类似物、以及它们的衍生物、片段和同系物。本发明的多核苷酸可以是单链的、双链的或三链的。例如,考虑RNA密码子的第三位中可容忍的但是作为不同的RNA密码子编码相同氨基酸的摆动性(wobble)(参见Stothard P,Biotechniques 28:1102-4(2000)),公开的多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码本发明示例性蛋白的多核苷酸。

在一个方面中,本发明提供编码本发明的蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸。多核苷酸可以包括,例如,编码与包含本发明的蛋白的氨基酸序列中的一个的多肽具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%以上的同一性的多肽的核酸序列。本发明还包括包含与编码本发明的蛋白、或其片段或衍生物的多核苷酸在严格条件下杂交的核苷酸序列,或者任何这种序列的反义序列或互补序列的多核苷酸。

本发明的多核苷酸(或蛋白)的衍生物或类似物包括,尤其是,具有与本发明的多核苷酸或蛋白基本同源的区域的多核苷酸(或多肽)分子,例如与相同尺寸的多核苷酸或多肽序列相比,或者当与比对的序列(其中所述比对由本领域中已知的计算机同源性程序进行)相比时,至少约45%、50%、70%、80%、95%、98%、或甚至99%的同一性(并且优选的同一性为80-99%)。示例性的程序是使用默认设置的GAP程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for UNIX,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison,WI,U.S.),其使用Smith T,Waterman M,Adv.Appl.Math.2:482-9(1981)的算法。还包括能够与编码本发明的蛋白的序列的互补序列在严格条件下杂交的多核苷酸(参见例如Ausubel F等,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,New York,NY,U.S.,1993)),以及以下。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,NY,U.S.,Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。

本发明还提供包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。可以使用本领域内公知的材料和五分时时彩方法将能够编码本发明的蛋白的多核苷酸插入至包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体在内的已知载体中以产生表达载体。这种表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如以下实施例中描述的pTxb1和pIVEX 2.3)中产生预期的本发明的蛋白所需的多核苷酸。用于与特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统一起使用的包含具体的多核苷酸的表达载体对本领域普通技术人员来说是公知的,可以是使用常规实验确定的,或者可以是购买的。

如在本文中所使用的,术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元线性或环形的多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够提供核酸区段在宿主细胞中的表达的多核苷酸区段。表达单元通常包含均处于可操作构型的转录启动子、编码目标多肽的开放阅读框、和转录终止子。表达载体含有一个或多个表达单元。因此,在本发明上下文中,编码包含单个多肽链(例如具有志贺毒素效应子区的遗传重组的scFv)的本发明的蛋白的表达载体至少包括用于该单个多肽链的表达单元,而编码包含例如两个以上多肽链(例如与毒素效应子区连接的包含VL结构域的一条链和包含VH结构域的第二链)的表达载体包括至少两个表达单元,各自用于所述蛋白的两条多肽链中的每一个。对于本发明的多链蛋白的表达,用于每条多肽链的表达单元还可以单独地包含在不同的表达载体中(例如,可以利用已经向其中引入用于每条多肽链的表达载体的单一宿主细胞实现表达)。

能够引导多肽和蛋白的瞬时或稳定表达的表达载体是在本领域内公知的。表达载体通常包括,但不限于下列各项中的一种或多种:异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列,其中的每一个均为在本领域内公知的。任选的调节控制序列、整合序列、和可以采用的可用标记物是在本领域中已知的。

术语“宿主细胞”是指可以支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞,如大肠杆菌,或者真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类、或哺乳动物细胞)。可以使用在本领域中已知的标准技术来实现包含本发明的多核苷酸或能够产生本发明的蛋白的宿主细胞系的创建和分离。

在本发明的范围内的蛋白可以是在本文中所描述的蛋白的变体或衍生物,其是这样产生的:通过改变一个或多个氨基酸或者缺失或插入一个或多个氨基酸来修饰编码本发明公开的蛋白的多核苷酸以可以使其更适用于实现所需性质,如通过宿主细胞的更优的表达。

VIII.递送装置和试剂盒

在某些实施方案中,本发明涉及一种装置,其包含用于递送给受试者的本发明的物质的一种或多种组合物,诸如药物组合物。因而,包含本发明的一种或多种化合物的递送装置可以用于通过多种递送五分时时彩方法给患者施用本发明的物质的组合物,所述递送五分时时彩方法包括:静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射;口服施用;透皮施用;肺或透粘膜施用;通过植入物、渗透泵、筒或微量泵施用;或通过本领域技术人员公知的其它方式。

试剂盒也在本发明范围内,所述试剂盒包含本发明的物质的至少一种组合物和任选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可以任选地包含至少一种另外的试剂(例如,标准品、标志物等)。试剂盒典型地包括标签,所述标签指示试剂盒的内容物的预期用途。所述试剂盒还可以包含用于检测在样品中或在受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)或用于诊断患者是否属于对利用如本文中所述的本发明的化合物、组合物或有关五分时时彩方法的治疗策略做出应答的群体的试剂和其它工具。

IX.使用本发明的蛋白或其组合物的五分时时彩方法

通常,本发明的一个目的是提供药理学上有活性的试剂、以及包含它们的组合物,它们可以用于预防和/或治疗疾病、病症和病患,诸如某些癌症、肿瘤、免疫病症、微生物感染、或在本文中提及的其它病理学状况。因此,本发明提供了使用本发明的蛋白和药物组合物的五分时时彩方法,其用于靶向杀死细胞,用于将另外的外源物质递送进靶向细胞中,用于标记靶向细胞的内部,用于收集诊断信息,和用于治疗如本文中所述的疾病、病症和病患。

具体地,本发明的一个目的是提供这样的药理学上有活性的试剂、组合物和/或五分时时彩方法,其与本领域目前已知的试剂、组合物和/或五分时时彩方法相比具有某些优点。因此,本发明提供了使用特征在于特定的多肽序列的本发明的蛋白及其药物组合物的五分时时彩方法。例如,在SEQ ID NO:1-31中的任一个多肽序列可以具体地用作在下述五分时时彩方法中使用的蛋白的组分。

本发明提供了杀伤细胞的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括下述步骤:使体外或体内细胞与本发明的蛋白或药物组合物接触。在使一个或多个细胞与要求保护的物质的组合物之一接触以后,本发明的蛋白和药物组合物可以用于杀伤特定细胞类型。在某些实施方案中,本发明的蛋白或药物组合物可以用于杀伤不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型,诸如包含癌细胞、受感染的细胞和/或血液细胞的混合物。在某些实施方案中,本发明的蛋白或药物组合物可以用于杀伤不同细胞类型的混合物中的癌细胞。在某些实施方案中,本发明的蛋白或药物组合物可以用于杀伤不同细胞类型的混合物中的特定细胞类型,诸如移植前组织。在某些实施方案中,本发明的蛋白或药物组合物可以用于杀伤细胞类型的混合物中的特定细胞类型,诸如用于治疗目的的施用前组织材料。在某些实施方案中,本发明的蛋白或药物组合物可以用于选择性地杀伤被病毒或微生物感染的细胞,或以其它方式选择性地杀伤表达特定细胞外靶标生物分子(诸如细胞表面生物分子)的细胞。本发明的蛋白和药物组合物具有多种应用,包括,例如,用于从体外或体内组织除去不希望的细胞类型,用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病,用作抗病毒剂,用作抗寄生虫剂,和用于净化移植组织的不希望的细胞类型。

在某些实施方案中,当施用给受试者中(诸如需要治疗的患者中)的体外或体内细胞群体时,本发明的蛋白或药物组合物(单独地或与其它化合物或药物组合物组合地)可以表现出有效的细胞杀伤活性。通过使用高亲和力免疫球蛋白型结合区使酶活性志贺毒素区域的递送靶向癌细胞型,可以将该有效的细胞杀伤活性限于特异性地和选择性地杀伤生物体内的特定细胞类型,诸如某些癌细胞、赘生性细胞、恶性细胞、非恶性肿瘤细胞或受感染的细胞。

本发明提供了一种杀伤患者中的细胞的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括下述步骤:给有此需要的患者施用至少一种本发明的蛋白或其药物组合物。

本发明的蛋白或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与癌症或肿瘤细胞物理上关联的细胞外生物分子而杀死患者中的癌细胞和/或肿瘤细胞。术语“癌细胞”或“癌性细胞”表示以异常加速的方式生长和分裂的各种赘生性细胞,且是技术人员显而易见的。术语“肿瘤细胞”包括恶性的和非恶性的细胞(例如,非癌性的、良性的肿瘤细胞、非癌性的“癌症”干细胞、肿瘤干细胞、恶性癌症前起始细胞、肿瘤起始细胞、或肿瘤发生细胞,它们可以产生变成恶性肿瘤和/或癌细胞但本身不能转移的子细胞(参见,例如,Martinez-Climent J等,Haematologica 95:293-302(2010)))。通常,癌症和/或肿瘤可以定义为适合治疗和/或预防的疾病、病症或病患。可能受益于本发明的五分时时彩方法和组合物的、由癌细胞和/或肿瘤细胞构成的癌症和肿瘤(恶性的或非恶性的)是技术人员显而易见的。赘生性细胞经常与以下一种或多种相关:失调的生长、分化的缺失、局部组织侵入、血管生成和转移。

本发明的蛋白或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与免疫细胞物理上关联的细胞外生物分子而杀死患者中的免疫细胞(无论是健康的还是恶性的)。

本发明的蛋白或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与受感染的细胞物理上关联的细胞外生物分子而杀死患者中受感染的细胞。

为了以下目的利用本发明的蛋白或其药物组合物是在本发明范围内:净化患者细胞群体(例如骨髓)的被感染的、恶性的、肿瘤性的、或在其它方面不希望的B-细胞和/或T-细胞,然后将除去了B-细胞和/或T-细胞的物质重新输入患者中(参见例如van Heeckeren W等,Br J Haematol 132:42-55(2006);Alpdogan O,van den Brink M,Semin Oncol 39:629-42(2012))。

为了以下目的利用本发明的蛋白或其药物组合物是在本发明范围内:从取自患者的分离的细胞群体离体除去B-细胞和/或T细胞。在一个非限制性实施例中,本发明的蛋白可以用在用于预防器官和/或组织移植排斥的五分时时彩方法中,其中在移植本发明的细胞毒性蛋白或其药物组合物之前灌注供体器官或组织,以便净化器官的不需要的供体B-细胞和/或T-细胞(参见例如Alpdogan O,van den Brink M,Semin Oncol 39:629-42(2012))。

为了以下目的利用本发明的蛋白或其药物组合物也是在本发明范围内:从供体细胞群体除去B-细胞和/或T-细胞作为要接受骨髓和/或干细胞移植的患者中针对移植物抗宿主病和耐受性诱导的预防。

本发明的蛋白或其药物组合物的某些实施方案可以用于通过靶向被发现与受感染的细胞物理上关联的细胞外生物分子而杀死患者中受感染的细胞。

本发明的蛋白或其药物组合物的某些实施方案可以用于杀伤多细胞寄生虫的细胞。在某些其他实施方案中,在所述多细胞寄生虫存在于宿主生物体或受试者中时,发生所述细胞杀伤。在某些其他实施方案中,本发明的蛋白可以用于杀伤蠕虫(helminth),诸如,例如,扁形动物(plathelminth),线虫(nemathelminth),绦虫(cestode),mongenean,线虫(nematode),和/或吸虫(trematode)。

另外,本发明提供了治疗患者中疾病、病症或病患的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括下述步骤:给有此需要的患者施用治疗有效量的至少一种本发明的蛋白或其药物组合物。可以使用该五分时时彩方法治疗的预见到的疾病、病症或病患包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常、免疫病症和微生物感染。“治疗上有效剂量”的本发明的化合物的施用可以导致疾病症状的严重程度的降低,无疾病症状阶段的频率和持续时间的增加,或由疾病折磨而导致的损害或残疾的预防。

本发明的化合物的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的哺乳动物的类型、和在考虑中的特定患者的体格特征。这些因素以及它们与确定这种量的关系是医学领域的技术从业人员众所周知的。这种量和施用五分时时彩方法可以进行调节以实现最佳效力,并且可以取决于医学领域的技术人员众所周知的因素,如重量、饮食、并存的药物和其它因素。最适用于人类用途的剂量大小和定量施用方案可以由通过本发明得到的结果指导,并且可以在适当地设计的临床试验中确认。通过常规方式,在实验动物中以低剂量开始并且然后在监测效果的同时增加剂量、以及系统性地改变给药方案,可以确定有效剂量和治疗方案。当为给定受试者确定最佳剂量时,临床医师可以考虑许多因素。这样的考虑因素是技术人员已知的。

可接受的施用途径可以表示在本领域中已知的任何施用途径,包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼、口服、肠胃外、直肠、阴道或透皮(例如,乳膏、凝胶或软膏的局部施用,或借助于透皮贴剂)。“肠胃外施用”典型地与在预期作用部位处的注射有关或与预期作用部位连通,包括肿瘤内注射、眶下、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、透粘膜或经气管施用。

关于本发明的药物组合物的施用,剂量范围通常将为约0.0001-100毫克/千克(mg/kg)宿主体重,并且更通常为0.01-5mg/kg宿主体重。示例性剂量可以是0.25mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案是每天一次或两次施用,或每周一次或两次施用,每两周一次,每三周一次,每四周一次,每月一次,每两个月或三个月一次或者每三至六个月一次。剂量可以由熟练的健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使对于特定患者而言的治疗益处最大化。

本发明的药物组合物典型地将会在多种情形下施用给相同患者。单次剂量之间的间隔可以是,例如,2-5天、每周、每月、每两个月或三个月、每六个月、或每年。基于调节受试者或患者中的血液水平或其它标志物,施用之间的间隔也可以是不规律的。本发明的化合物的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重的静脉内施用,其中将化合物每两至四周施用一次达六个剂量,然后以3mg/kg体重或1mg/kg体重每三个月施用一次。

使用本领域已知的多种五分时时彩方法中的一种或多种,可以经由一种或多种施用途径施用本发明的药物组合物。如技术人员将会理解的,施用的途径和/或模式将会根据期望的结果而变化。本发明的蛋白或其组合物的施用途径包括,例如静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它肠胃外施用途径,例如,通过在预期作用部位处的或与预期作用部位连通的注射或输注(例如,肿瘤内注射)。在其它实施方案中,本发明的蛋白或药物组合物可以通过非肠胃外途径施用,诸如局部、表皮或粘膜施用途径,例如,鼻内地、口服地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。

利用本领域已知的多种医疗装置中的一种或多种,可以施用本发明的蛋白或药物组合物。例如,在一个实施方案中,可以利用无针皮下注射装置施用本发明的药物组合物。在本领域中具有可用于本发明的众所周知的植入物和模块的例子,包括例如,用于受控速率递送的可植入微量输液泵;用于穿过皮肤施用的装置;用于以精确的输注速率递送的输液泵;用于连续药物递送的可变流可植入输注装置;以及渗透药物递送系统。这些和其它这样的植入物、递送系统、和模块是本领域技术人员已知的。

本发明的蛋白或药物组合物可以单独施用或者与一种或多种其它治疗剂或诊断剂联合施用。联合治疗可以包括与至少一种其它治疗剂组合的本发明的蛋白或其药物组合物,所述其它治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病患而选择。其它这样的药剂的例子包括,尤其是,细胞毒性的抗癌剂或化学治疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段、或调节一个或多个信号传导途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性处理方案中互补的或在其它方面有益的类似调节治疗剂。

用本发明的蛋白或药物组合物对患者的治疗优选地导致被靶向的细胞的细胞死亡和/或被靶向的细胞的生长抑制。这样,本发明的蛋白和包含它们的药物组合物将可用在治疗多种病理学病症(其中杀死或除去靶细胞可能是有益的,例如尤其是癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和受感染的细胞)的五分时时彩方法中。本发明提供了用于抑制细胞增殖和治疗细胞病症(包括瘤形成、过度活跃的B-细胞和过度活跃的T-细胞)的五分时时彩方法。

在某些实施方案中,本发明的蛋白和药物组合物可以用于治疗或预防癌症、肿瘤(恶性的和非恶性的)、生长异常、免疫病症和微生物感染。在另一个方面,以上离体五分时时彩方法可以与以上体内五分时时彩方法组合以提供治疗或预防骨髓移植接受者中的排斥的五分时时彩方法和用于实现免疫耐受的五分时时彩方法。

在某些实施方案中,本发明提供了治疗哺乳动物受试者(诸如人)中的恶性病或肿瘤和其它血细胞相关癌症的五分时时彩方法,所述五分时时彩方法包括下述步骤:给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的蛋白或药物组合物。

本发明的蛋白和药物组合物具有多种用途,包括,例如,用于除去不希望的B-细胞和/或T-细胞,用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病,用作抗病毒剂,用作抗微生物剂,和用于净化移植组织的不希望的细胞类型。本发明的蛋白和药物组合物通常是抗肿瘤剂——意味着它们能够通过抑制癌症或肿瘤细胞的生长和/或造成癌症或肿瘤细胞的死亡而治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟或传播。

在某些实施方案中,本发明的蛋白或药物组合物用于治疗B-细胞-、浆细胞-、T-细胞或抗体-介导的疾病或病症,诸如例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征HIV-相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多发性动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。

在另一个方面,本发明的蛋白和药物组合物的某些实施方案是抗微生物剂——意味着它们能够治疗和/或预防微生物致病感染(诸如由病毒、细菌、真菌、朊病毒或原生动物造成)的获得、发展或后果。

提供对由B-细胞和/或T-细胞介导的疾病或病患的预防或治疗的五分时时彩方法在本发明的范围内,所述预防或治疗包括向由此需要的患者施用本发明的蛋白或其药物组合物,用于杀伤所述患者中的B-细胞和/或T-细胞的目的。该用法与准备或调理患者用于骨髓移植、干细胞移植、组织移植或器官移植相容,而无论移植的物质的来源,例如人或非人来源。

提供通过用本发明的蛋白或药物组合物对宿主B细胞、NK细胞和/或T细胞的靶向性细胞杀伤的骨髓接受体在本发明的范围内,用于预防或治疗宿主抗移植物疾病(参见,例如,Sarantopoulos S等,Biol Blood Marrow Transplant 21:16-23(2015))。

本发明的蛋白和药物组合物可以用在治疗癌症的五分时时彩方法中,所述五分时时彩方法包括:给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的蛋白或药物组合物。在本发明的五分时时彩方法的某些实施方案中,正在治疗的癌症选自由下述组成的组:骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)和子宫癌。

本发明的蛋白和药物组合物可以用在治疗免疫病症的五分时时彩方法中,所述五分时时彩方法包括:给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的蛋白或药物组合物。在本发明的五分时时彩方法的某些实施方案中,所述免疫病症与炎症有关,所述炎症与选自由以下组成的组的疾病有关:淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多发性动脉炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。

在本发明的某些实施方案中是使用本发明的蛋白作为药物组合物或药物的组分,所述药物组合物或药物用于治疗或预防癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症和/或微生物感染。例如,可以用这样的药物治疗在患者的皮肤上呈现的免疫病症,以尝试减少炎症,。在另一个实施例中,可以用这样的药物治疗皮肤肿瘤,以尝试减小肿瘤大小或完全消除肿瘤。

本发明的某些蛋白可以用在分子神经外科应用中,诸如免疫损伤(immunolesioning)和神经元示踪(关于综述,参见,Wiley R,Lappi D,Adv Drug Deliv Rev 55:1043-54(2003))。例如,可以从各种配体(诸如神经递质和神经肽)选择或衍生出靶向结构域,其通过结合神经元表面受体(诸如神经元回路特异性的G-蛋白连接的受体)而靶向特定神经元细胞类型。类似地,所述靶向结构域可以选自或源自结合神经元表面受体的抗体。因为志贺毒素稳健地指导它们自身的逆向轴突运输,本发明的某些细胞毒性蛋白可以用于杀死在远离细胞体的细胞毒性蛋白注射部位处表达所述细胞外靶标的神经元(参见Llewellyn-Smith I等,J Neurosci Methods 103:83-90(2000))。这些神经元细胞类型特异性的靶向细胞毒性蛋白用在神经科学研究中,诸如用于阐明感觉的机制(参见例如Mishra S,Hoon M,Science 340:968-71(2013)),和建立神经变性疾病(诸如帕金森病和阿尔茨海默病)的模型系统(参见例如Hamlin A等,PLoS One e53472(2013))。

为了关于疾病、病患和/或病症的信息收集的目的,在本发明的某些实施方案中是使用本发明的蛋白、药物组合物和/或诊断组合物检测细胞类型的存在的五分时时彩方法。所述五分时时彩方法包括使细胞与诊断足够量的本发明的蛋白接触以通过测定或诊断技术检测所述蛋白。短语“诊断足够量”表示为了信息收集目的通过利用的特定测定或诊断技术提供充分检测和准确测量的量。通常,对于完整生物体内诊断应用而言,诊断足够量是每位受试者在0.1mg至100mg本发明的检测促进剂连接的蛋白/千克受试者之间的非累积剂量。典型地,在这些信息收集五分时时彩方法中使用的本发明的蛋白的量将尽可能地低,前提条件是,它仍然是诊断足够量。例如,对于在生物体中的体内检测,施用给受试者的本发明的蛋白的量将可行地尽可能地低。

与检测促进剂组合的本发明的蛋白的细胞类型特异性的靶向提供检测细胞并获取其图像的方式,所述细胞与本发明的蛋白的结合区的细胞外靶标生物分子物理上关联。使用本发明的蛋白对细胞的成像可以通过本领域已知的任意合适的技术在体外或在体内执行。例如,为了信息收集的目的,使用本发明的蛋白、药物组合物或诊断组合物检测细胞型的存在的五分时时彩方法可以在患者内的体内细胞上进行,特别在原位细胞上进行,例如,在疾病病灶处,在体外细胞上,和/或在从生物体去除的细胞和组织(例如,活组织检查物质)上以离体设置进行。

使用本领域已知的各种五分时时彩方法,包括生物体的全身成像或使用取自生物体的离体样品,可以收集诊断信息。本文中使用的术语样品表示任意数目的物品,但不限于,流体诸如血液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液,以及通过活组织检查操作得到的组织。例如,通过技术诸如磁共振成像(MRI)、光学五分时时彩方法(诸如直接的、荧光的和生物发光的成像)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声、x-射线计算机体层摄影术和前述技术的组合,多种检测促进剂可以用于非侵入性体内肿瘤成像(关于综述,参见Kaur S等,CancerLett 315:97-111(2012))。

使用本发明的蛋白、药物组合物或诊断组合物检测靶标生物分子阳性细胞型的存在(用于信息收集目的)的五分时时彩方法可以在患者内的体内细胞上进行,在原位细胞上进行,例如,在疾病病灶处,在体外细胞上,和/或在从生物体去除的细胞和组织(例如,活组织检查物质)上以离体设置进行。使用本发明的组合物检测特定细胞、细胞型和细胞群体可以用于细胞的诊断和成像,诸如,例如,肿瘤细胞、癌细胞、免疫细胞和被感染的细胞。例如,本发明的蛋白和诊断组合物可以用于成像或显现生物体中表达靶标生物分子的细胞可能累积的位点。这些五分时时彩方法可以用于鉴定治疗干预后肿瘤发展的位点或残留的肿瘤细胞。

用于检测细胞型的存在的五分时时彩方法的某些实施方案可以用于收集关于疾病、病症和病患的信息,诸如例如,骨癌(诸如多发性骨髓瘤或尤因肉瘤)、乳腺癌、中枢/周围神经系统癌症(诸如脑癌、神经纤维瘤病或胶质母细胞瘤)、胃肠癌(诸如胃癌或结直肠癌)、生殖细胞癌(诸如卵巢癌和睾丸癌、腺癌(诸如胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、唾液腺癌或甲状腺癌)、头颈癌(诸如鼻咽癌、口癌或咽癌)、血液学癌症(诸如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、肾-尿道癌(诸如肾癌和膀胱癌)、肝癌、肺/胸膜癌(诸如间皮瘤、小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、前列腺癌、肉瘤(诸如血管肉瘤、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤或滑膜肉瘤)、皮肤癌(诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤)、子宫癌、AIDS、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、孤独症(autism)、心脏发生(cardiogenesis)、克罗恩病、糖尿病、红斑(erythematosus)、胃炎(gastritis)、移植排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒性综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、淋巴增生性障碍(lymphoproliferative disorders)、多发性硬化、重症肌无力(myasthenia gravis)、神经炎症(neuroinflammation)、结节性多发性动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、溃疡性结肠炎、血管炎、细胞增殖、炎症、白细胞激活、白细胞粘附、白细胞趋化性、白细胞成熟、白细胞迁移、神经元分化、急性淋巴母细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、T急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤(ALL)、急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、B-细胞前淋巴细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma,BL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML-BP)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、血管内大B-细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)、天然杀伤细胞白血病、结节边缘B-细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞白血病、浆细胞瘤、原发性渗出性淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、脾边缘带淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤(TCL)、重链病、单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy)、单克隆免疫球蛋白沉积病、骨髓增生异常综合征(MDS)、郁积型多发性骨髓瘤和Waldenstrom巨球蛋白血症。

在本发明的某些实施方案中是使用本发明的蛋白、药物组合物和/或诊断组合物标记或检测赘生性细胞和/或免疫细胞类型的内部的五分时时彩方法(参见例如,Koyama Y等,Clin Cancer Res 13:2936-45(2007);Ogawa M等,Cancer Res 69:1268-72(2009);Yang L等,Small 5:235-43(2009))。基于本发明的蛋白和药物组合物进入特定细胞类型并通过逆向细胞内运输在细胞内按路线发送的能力,特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者内在原位细胞上执行,或在从生物体取出的细胞和组织(例如活组织检查材料)上执行。

本发明的诊断组合物可以用于将疾病、病症或病患表征为本发明的有关药物组合物潜在地可治疗的。本发明的物质的某些组合物可以用于确定患者是否属于对利用如本文中所述的本发明的化合物、组合物或有关五分时时彩方法的治疗策略做出应答或非常适合使用本发明的递送装置的组。

可以在检测出疾病(例如癌症)以后使用本发明的诊断组合物,以便更好地表征它,诸如以监测远距离转移、异质性和癌症进展阶段。疾病病症或感染的表型评估可以帮助在做出治疗决策的过程中的预后和预测。在疾病复发中,本发明的某些五分时时彩方法可以用于确定是局部还是全身问题。

本发明的诊断组合物可以用于评估对治疗剂的应答,无论治疗剂的类型,例如小分子药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如,本发明的诊断的某些实施方案可以用于测量肿瘤大小的变化、抗原阳性细胞群体(包括数目和分布)的变化、和/或监测已经施用给患者的疗法所靶向的抗原以外的标志物(参见,例如Smith-Jones P等,Nat Biotechnol 22:701-6(2004);Evans M等,Proc Natl Acad Sci U.S.A.108:9578-82(2011))。

在某些实施方案中,本发明的蛋白或其药物组合物和/或诊断组合物用于诊断和治疗,或仅用于诊断。

下述选择性的细胞毒性蛋白的非限制性实施例进一步举例说明了本发明,所述选择性的细胞毒性蛋白包含来源于志贺毒素家族成员的A亚基的志贺毒素效应子区和能够结合与特定细胞型物理连接的细胞外靶标生物分子的免疫球蛋白型结合区。

实施例

以下实施例证实了本发明的某些实施方案。但是,应当理解,这些实施例仅仅用于解释目的,且不意图、也不应当解释为对本发明的条件和范围的一概限制。除了另外详细描述以外,使用本领域技术人员众所周知的且常规的标准技术进行以下实施例中的实验。

下述实施例证明了示例性的细胞毒性蛋白较之它们相反方向的蛋白变体提高的选择性杀伤与免疫球蛋白型结合区的细胞外靶标生物分子物理连接的细胞的能力。所述示例性的细胞毒性蛋白结合被靶向的细胞表达的靶标生物分子并且进入该被靶向的细胞。内在化的细胞毒性蛋白有效地将它们的志贺毒素效应子区按路线发送到细胞溶胶中,以使核糖体失活,然后引起被靶向的细胞的凋亡死亡。

一种示例性的细胞毒性蛋白包含与能够以高亲和力结合CD38的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段。该示例性的细胞毒性蛋白能够选择性杀伤在细胞表面上表达CD38的细胞。第二示例性的细胞毒性蛋白包含与能够以高亲和力结合HER2的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段。该第二示例性的细胞毒性蛋白能够选择性杀伤在细胞表面上表达HER2的细胞。第三示例性的细胞毒性蛋白包含与能够以高亲和力结合CD19的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段。该第三示例性的细胞毒性蛋白能够选择性杀伤在细胞表面上表达CD19的细胞。第四示例性的细胞毒性蛋白包含与能够以高亲和力结合CD74的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段。该第四示例性的细胞毒性蛋白能够选择性杀伤在细胞表面上表达CD74的细胞。其他示例性的细胞毒性蛋白包括具有靶向EB抗原(Epstein-Barr antigens)、利什曼原虫抗原(Leishmania antigens)、神经降压肽受体、表皮生长因子受体和免疫细胞受体CCR5的结合的那些细胞毒性蛋白。

实施例1.来源于志贺样毒素-1的A亚基的CD38-靶向的细胞毒性蛋白(SLT-1A::αCD38scFv)

本实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD38scFv包含与能够以高亲和力结合CD38的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段,从而所述志贺毒素效应子区比CD38结合区更邻近所述细胞毒性蛋白的氨基端。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD38scFv的构建、产生和纯化

第一,设计或选择志贺毒素效应子区和免疫球蛋白型结合区。在该实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。获得编码SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等,Mol Cancer 9:28(2010)。免疫球蛋白型结合区αCD38scFv来源于单克隆抗体抗-CD38 HB7(Peng等,Blood 101:2557-62(2003);还参见GenBank Accession BD376144,National Center for Biotechnology Information,U.S.),使得产生具有通过本领域已知的接头隔开的两个免疫球蛋白可变区(VL和VH)的单链可变片段(scFv)。

第二,将结合区和志贺毒素效应子区连接在一起形成融合蛋白。在该实施例中,将编码来自SLT-1A的志贺毒素效应子区(SEQ ID NO:1的氨基酸1-251)的多核苷酸与编码接头(如来源于鼠IgG3分子的“鼠铰链”(或技术人员已知的其他接头))的多核苷酸符合阅读框地克隆,并且与编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸269-508的免疫球蛋白型结合区αCD38scFv的多核苷酸符合阅读框地克隆。在某些实验中,本实施例的细胞毒性蛋白的全长编码序列以编码的多核苷酸起始,以促进检测和纯化。使用DNA 2.0,Inc.(Menlo Park,CA,U.S.)的服务,将编码本实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD38scFv的多核苷酸序列进行密码子优化,用以在大肠杆菌中有效的表达。

第三,通过表达编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD38scFv(SEQ ID NO:4)的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αCD38scFv细胞毒性蛋白的表达使用细菌和无细胞的蛋白翻译系统实现。

在通过大肠杆菌表达系统产生SLT-1A::αCD38scFv的该实施例中,使用标准五分时时彩方法将编码SLT-1A::αCD38scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1载体(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中,以产生与编码载体的氨基端内蛋白的多核苷酸序列符合阅读框连接的编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD38scFv的多核苷酸序列。通过Sanger测序(Functional Biosciences,Madison,WI,U.S.)验证质粒插入多核苷酸序列,并且将其转化到T7细胞(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中。产生SLT-1A::αCD38scFv蛋白,并且按照IMPACTTM(具有亲和性壳多糖结合标记的内蛋白介导的纯化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系统手册(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)进行纯化。纯化使用本领域已知的标准技术实现,诸如使用或免疫球蛋白型结合区的固定的靶标。

在通过无细胞蛋白翻译系统产生SLT-1A::αCD38scFv的该实施例中,使用HD克隆试剂盒(Clonetech,Mountain View,CA,U.S.),按照供应商的使用说明,将编码SLT-1A::αCD38scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pIVEX2.3载体中,所述载体具有紧接在编码区后的终止密码子。通过Sanger测序(Functional Biosciences,Madison,WI,U.S.)验证质粒插入多核苷酸序列。使用快速翻译系统5 PrimeTM RTS 100大肠杆菌二硫化物试剂盒(5 Prime,Gaithersburg,MD,U.S.),按照供应商的使用说明,产生SLT-1A::αCD38scFv蛋白。使用本领域已知的标准技术实现纯化,诸如使用或免疫球蛋白型结合区的固定的靶标。

确定结合靶细胞型的SLT-1A::αCD38scFv的最大特异性结合(Bmax)和平衡结合常数(KD)

如上述产生的SLT-1A::αCD38scFv蛋白的结合特征通过基于荧光的流式细胞测定来确定。将包含CD38阳性(+)细胞和CD38阴性(-)细胞的样品悬浮在1X PBS+1%BSA中,并与100μL要测定的SLT-1A::αCD38scFv蛋白的不同稀释液在4℃温育1小时。选择SLT-1A::αCD38scFv蛋白的最高浓度,以导致结合反应饱和。一小时温育后,将细胞样品用1X PBS+1%BSA洗涤两次。将细胞样品与100μL包含0.3μg抗mAb-FITC(# A01736-100,Genscript,Piscataway,NJ,U.S.)的1X PBS+1%BSA在4℃温育1小时。

接着,将细胞样品用1X PBS+1%BSA洗涤两次,重悬在200μL 1X PBS中,并且进行基于荧光的流式细胞术。使用仅有FITC的样品作为阴性对照,通过门控数据得到关于所有样品的平均荧光强度(MFI)数据。使用Prism软件(GraphPad Software,San Diego,CA,U.S.)绘制MFI相对于“细胞浓度”的图。使用在主题结合-饱和下的Prism软件单位点结合函数[Y=Bmax*X/(KD+X)],用基线校正的数据计算Bmax和KD。通过减去对仅包含PBS的孔测量的Abs值,针对背景校正Abs值。Bmax是以MFI报道的最大特异性结合。KD是平衡结合常数,以nM为单位报道。

测量SLT-1A::αCD38scFv与CD38+细胞结合的Bmax为约100,000MFI,KD约13nM(表1)。该结果与反方向蛋白αCD38scFv::SLT-1A与CD38+细胞结合的Bmax相似,测量其为约110,000MFI,KD约17nM(表1)。蛋白无一结合CD38-细胞。这表明“改造的方向”作用可能与免疫球蛋白来源的结构域的靶细胞结合特异性的干扰无关。

表1.改造方向对结合特征没有显著影响:与反方向αCD38scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αCD38scFv的Bmax和KD的代表值

在体外确定SLT-1A::αCD38scFv针对真核细胞核糖体的半最大抑制浓度(IC50)

使用快速连接转录/翻译试剂盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit,L1170 Promega,Madison,WI,U.S.,以无细胞体外蛋白翻译测定,确定SLT-1A::αCD38scFv的核糖体灭活能力。所述试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA和Master Mix。根据生产商的说明书准备核糖体活性反应,以产生“TNT”反应混合物。

在适当的缓冲液中制备一系列待测SLT-1A::αCD38scFv的10倍稀释液,并且为每个SLT-1A::αCD38scFv稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物组分。将在SLT-1A::αCD38scFv蛋白稀释系列中的每个样品与TNT反应混合物中的每一个以及荧光素酶T7对照DNA合并。将试验样品在30℃温育1.5小时。在温育之后,将荧光素酶测定试剂(E1483 Promega,Madison,WI,U.S.)加入到所有试验样品中,并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。通过总蛋白的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线性回归分析,确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.),计算每个样品的半最大抑制浓度(IC50)值。然后,通过使用Prism软件在主题剂量-响应-抑制下的log(抑制剂)相对于反应(三个参数)的函数[Y=底部+((顶部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]计算“仅有SLT-1A的对照蛋白的百分数”,而使数据标准化。计算实验蛋白和仅有SLT-1A的对照蛋白的IC50。通过[(SLT-1A对照蛋白的IC50/实验蛋白的IC50)x 100]计算仅有SLT-1A的对照蛋白的百分数。

SLT-1A::αCD38scFv对无细胞的蛋白合成的抑制作用强。剂量依赖性实验确定在该无细胞测定中SLT-1A::αCD38scFv对蛋白合成的IC50为约14皮摩尔(pM)或为仅有SLT-1A的阳性对照的109%(表2)。这一结果与关于反方向蛋白αCD38scFv::SLT-1A的IC50没有实质不同,测量反方向蛋白αCD38scFv::SLT-1A的IC50为约15pM或与仅有SLT-1A的阳性对照同等(表2)。这表明“改造的方向”作用可能与志贺毒素A亚基酶活性的任何明显的干扰无关。

表2.改造方向对核糖体失活没有显著影响:与反方向αCD38scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αCD38scFv的代表性半最大抑制浓度(IC50)

使用细胞杀伤测定确定SLT-1A::αCD38scFv的选择性细胞毒性和半最大细胞毒性浓度(CD50)

通过下述细胞杀伤测定确定SLT-1A::αCD38scFv的细胞毒性特征。该测定确定细胞毒性蛋白杀伤表达所述细胞毒性蛋白的免疫球蛋白型结合区的靶标生物分子的细胞的能力(与不表达所述靶标生物分子的细胞相比)。将细胞接种在384孔平板的20μL细胞培养基中(2x103个细胞/孔)。将SLT-1A::αCD38scFv蛋白在1X PBS中稀释5倍或10倍,并且将5μL稀释液加入到细胞中。使用仅包含细胞培养基的对照孔进行基线校正。将细胞样品与SLT-1A::αCD38scFv、或仅与缓冲液在37℃在5%CO2气氛中温育3天。使用发光细胞存活测定(Luminescent Cell Viability Assay,G7573 Promega Madison,WI,U.S.),按照供应商的使用说明,用发光读数确定总细胞存活或存活力百分数。使用下述方程计算实验孔的存活力百分数:(试验RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)中绘制对数多肽浓度相对于存活力百分数的图,并且利用log(抑制剂)相对于标准化的反应(可变斜率)分析确定SLT-1A::αCD38scFv的半最大细胞毒性浓度(CD50)值。

剂量依赖性实验确定,SLT-1A::αCD38scFv蛋白对CD38+细胞的CD50为约0.2-0.7nM,这取决于细胞系,相比较地,对CD38-细胞系为470nM,这与仅有SLT-1A的阴性对照的CD50相似(表3;图2)。同与细胞外靶标生物分子CD38物理连接的细胞(例如,在它们的细胞表面上表达CD38的细胞系)相比,SLT-1A::αCD38scFv对于不与细胞外靶标生物分子CD38物理连接的细胞的CD50高约700-3000倍(细胞毒性较小)(表3;图2)。测量以相反方向重组的相同蛋白结构域αCD38scFv::SLT-1A的CD50为约0.8-3.2nM(表3;图2)。这表明改进的改造方向(其中,相对于所述志贺毒素效应子区,所述免疫球蛋白型结合区不邻近细胞毒性蛋白的氨基端)赋予约4-6倍的针对CD38细胞的细胞毒性提高(表3)。这些结果示例了“改造的方向”作用对细胞毒性和选择性细胞毒性二者的影响。基于关于核糖体失活或靶细胞结合特征的体外结果,不能预测这些细胞毒性蛋白的细胞杀伤的差异。

表3.改造方向对细胞毒性的影响:与反方向αCD38scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αCD38scFv的代表性半最大细胞毒性浓度(CD50)

使用免疫荧光确定SLT-1A::αCD38scFv及其反方向αCD38scFv::SLT-1A的细胞内在化

使用本领域已知的标准免疫细胞化学技术研究细胞毒性蛋白进入靶细胞的能力。简言之,收集0.8x 106个每种细胞型(Raji(CD38+),Ramos(CD38+),Daudi(CD38+),BC-1(CD38+),和U266(CD38-))的细胞,并且悬浮在50μL包含蛋白酶抑制剂混合物(例如P1860Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,U.S.)和人Fc受体蛋白(以减少非特异性免疫荧光染色)的细胞培养基中。然后,将100nM待分析的细胞毒性蛋白加入到细胞中,并且将所述细胞在37℃温育1小时,以允许进行中毒。然后,使用Cytofix/CytopermTM试剂盒(BD Biosciences San Diego,CA,U.S.)按照供应商的使用说明,将细胞“固定”并“渗透化”。志贺毒素效应子区用小鼠单克隆抗体(小鼠IgG抗-志贺毒素1亚基A,BEI NR-867BEI Resources,Manassas,VA,U.S.)“染色”。然后用Alexa555单克隆抗体标记试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA,U.S.)按照供应商的使用说明检测该小鼠单克隆抗体的定位。

在该测定中,在CD38+细胞中,观察到针对SLT-1A::αCD38scFv和反方向蛋白αCD38scFv::SLT-1A二者的细胞表面结合和细胞内在化。没有观察到任一种蛋白向CD38-细胞的细胞内在化。这表明这两种变体(它们仅在它们的免疫球蛋白型结合区和志贺毒素效应子区的相对顺序方面不同)之间的细胞毒性差异(表3;图2)可能与靶细胞结合和/或细胞进入的任何显著的变化无关。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白αCD38scFv::SLT-1A的体内作用

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白αCD38scFv::SLT-1A对CD38+赘生性细胞和/或免疫细胞的体内作用。使用多种小鼠品系来检测在静脉内施用后细胞毒性蛋白对小鼠中异种移植的肿瘤的作用,所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞和/或人免疫细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达CD38)而产生。

实施例2.来源于志贺样毒素1的A亚基的HER2-靶向的细胞毒性蛋白(SLT-1A::αHER2scFv)

该实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αHER2scFv包含与能够以高亲和力结合HER2的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段,使得所述志贺毒素效应子区比HER2结合区更邻近所述细胞毒性蛋白的氨基端。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αHER-2scFv的构建、产生和纯化

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。获得编码SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等,Mol Cancer 9:28(2010))。免疫球蛋白型结合区αHER2scFv来源于曲妥珠单抗(曲妥珠单抗)(以市售,Genentech,South San Francisco,CA)单克隆抗体,如(Zhao等,J Immunol 183:5563-74(2009))所述,使得产生具有由接头隔开的两个免疫球蛋白可变区(VL和VH)的单链可变片段(scFv)。

在本实施例中,将免疫球蛋白型结合区和志贺毒素效应子区连接在一起形成融合蛋白。在该实施例中,将编码来自SLT-1A的志贺毒素效应子区(SEQ ID NO:1的氨基酸1-251)的多核苷酸与编码接头(如来源于鼠IgG3分子的“鼠铰链”(或技术人员已知的其他接头))的多核苷酸符合阅读框地克隆,并且与编码包含SEQ ID NO:8的氨基酸269-512的免疫球蛋白型结合区αHER2scFv的多核苷酸符合阅读框地克隆。在某些实验中,本实施例的细胞毒性蛋白的全长编码序列以编码的多核苷酸起始,以促进检测和纯化。使用DNA2.0,Inc.(Menlo Park,CA,U.S.)的服务,将编码本实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αHER2scFv的多核苷酸序列进行密码子优化,用以在大肠杆菌中有效的表达。

通过表达编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αHER2scFv(SEQ ID NO:8)的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αHER2scFv细胞毒性蛋白的表达使用细菌和无细胞的蛋白翻译系统实现。

在通过大肠杆菌表达系统产生SLT-1A::αHER2scFv的该实施例中,使用标准五分时时彩方法将编码SLT-1A::αHER2scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1载体(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中,以产生与编码载体的氨基端内蛋白的多核苷酸序列符合阅读框连接的编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αHER2scFv的多核苷酸序列。通过Sanger测序(Functional Biosciences,Madison,WI,U.S.)验证质粒插入多核苷酸序列,并且将其转化到T7细胞(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中。产生SLT-1A::αHER2scFv蛋白,并且按照IMPACTTM(具有亲和性壳多糖结合标记的内蛋白介导的纯化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系统手册(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)进行纯化。纯化使用本领域已知的标准技术实现,诸如使用或免疫球蛋白型结合区的固定的靶标。

在通过无细胞蛋白翻译系统产生SLT-1A::αHER2scFv的该实施例中,使用HD克隆试剂盒(Clonetech,Mountain View,CA,U.S.),按照供应商的使用说明,将编码SLT-1A::αHER2scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pIVEX2.3载体中,所述载体具有紧接在编码区后的终止密码子。通过Sanger测序(Functional Biosciences,Madison,WI,U.S.)验证质粒插入多核苷酸序列。使用快速翻译系统5 PrimeTMRTS 100大肠杆菌二硫化物试剂盒(5 Prime,Gaithersburg,MD,U.S.),按照供应商的使用说明,产生SLT-1A::αHER2scFv蛋白。使用本领域已知的标准技术实现纯化,诸如使用或免疫球蛋白型结合区的固定的靶标。

确定结合靶细胞型的SLT-1A::αHER2scFv的最大特异性结合(Bmax)和平衡结合常数(KD)

如上述产生的SLT-1A::αHER2scFv蛋白的结合特征通过基于荧光的流式细胞测定来确定。将包含HER2阳性(+)细胞和HER2阴性(-)细胞的样品悬浮在含有1%牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem,San Diego,CA,U.S.)的磷酸缓冲盐水(1X PBS)(Hyclone Brand,Fisher Scientific,Waltham,MA,U.S.)(以下表示为“1X PBS+1%BSA”)中,并与100μL要测定的SLT-1A::αHER2scFv蛋白的不同稀释液在4摄氏度(℃)温育1小时。选择SLT-1A::αHER2scFv蛋白的最高浓度,以导致结合反应饱和。一小时温育后,将细胞样品用1X PBS+1%BSA洗涤两次。将细胞样品与100μL包含0.3μg抗mAb-FITC(#A01736-100,Genscript,Piscataway,NJ,U.S.)的1X PBS+1%BSA在4℃温育1小时。

接着,将细胞样品用1X PBS+1%BSA洗涤两次,重悬在200μL 1X PBS中,并且进行基于荧光的流式细胞术。使用仅有FITC的样品作为阴性对照,通过门控数据得到关于所有样品的平均荧光强度(MFI)数据。使用Prism软件(GraphPad Software,San Diego,CA,U.S.)绘制MFI相对于“细胞浓度”的图。使用在主题结合-饱和下的Prism软件单位点结合函数[Y=Bmax*X/(KD+X)],用基线校正的数据计算Bmax和KD。通过减去对仅包含PBS的孔测量的Abs值,针对背景校正Abs值。Bmax是以MFI报道的最大特异性结合。KD是平衡结合常数,以纳摩尔(nM)为单位报道。

测量SLT-1A::αHER2scFv与HER2+细胞结合的Bmax为约230,000MFI,KD约110nM(表4)。该结果与反方向蛋白αHER2scFv::SLT-1A与HER2+细胞结合的Bmax相似,测量其为约140,000MFI,KD约180nM(表4)。在该测定中,观察到没有蛋白具有与HER2-阴性细胞的可测量的结合。这表明“改造的方向”作用可能与免疫球蛋白来源的结构域的靶细胞结合特异性的干扰无关。

表4.改造方向对结合特征没有影响:与反方向αHER2scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αHER2scFv的Bmax和KD的代表值

在体外确定SLT-1A::αHER2scFv针对真核细胞核糖体的半最大抑制浓度(IC50)

使用快速连接转录/翻译试剂盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit,L1170 Promega,Madison,WI,U.S.,以无细胞体外蛋白翻译测定,确定SLT-1A::αHER2scFv的核糖体灭活能力。所述试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA和Quick Master Mix。根据生产商的说明书准备核糖体活性反应,以产生“TNT”反应混合物。

在适当的缓冲液中制备一系列待测SLT-1A::αHER2scFv的10倍稀释液,并且为每个SLT-1A::αHER2scFv稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物组分。将在SLT-1A::αHER2scFv蛋白稀释系列中的每个样品与TNT反应混合物中的每一个以及荧光素酶T7对照DNA合并。将试验样品在30℃温育1.5小时。在温育之后,将荧光素酶测定试剂(E1483Promega,Madison,WI,U.S.)加入到所有试验样品中,并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。通过总蛋白的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线性回归分析,确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.),计算每个样品的半最大抑制浓度(IC50)值。然后,通过使用Prism软件在主题剂量-响应-抑制下的log(抑制剂)相对于反应(三个参数)的函数[Y=底部+((顶部-底部)/(1+10^(X-LogIC50)))]计算“仅有SLT-1A的对照蛋白的百分数”,而使数据标准化。计算实验蛋白和仅有SLT-1A的对照蛋白的IC50。通过[(SLT-1A对照蛋白的IC50/实验蛋白的IC50)x 100]计算仅有SLT-1A的对照蛋白的百分数。

SLT-1A::αHER2scFv对无细胞的蛋白合成的抑制作用强。剂量依赖性实验确定在该无细胞测定中SLT-1A::αHER2scFv对蛋白合成的IC50为约110pM或为仅有SLT-1A的阳性对照的19%(表5)。这一结果与关于反方向蛋白αHER2scFv::SLT-1A的IC50没有实质不同,测量反方向蛋白αHER2scFv::SLT-1A的IC50为仅有SLT-1A的阳性对照的108%(表5)。这表明“改造的方向”作用可能与志贺毒素A亚基酶活性的任何明显的干扰无关。

表5.改造方向对核糖体失活没有影响:与反方向αHER2scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αHER2scFv的代表性相对半最大抑制浓度(IC50)

使用细胞杀伤测定确定SLT-1A::αHER2scFv的选择性细胞毒性和半最大细胞毒性浓度(CD50)

通过下述细胞杀伤测定确定SLT-1A::αHER2scFv的细胞毒性特征。该测定确定细胞毒性蛋白杀伤表达所述细胞毒性蛋白的免疫球蛋白型结合区的靶标生物分子的细胞的能力(与不表达所述靶标生物分子的细胞相比)。将细胞接种在384孔平板的20μL细胞培养基中(2x103个细胞/孔)。将SLT-1A::αHER2scFv蛋白在1X PBS中稀释5倍或10倍,并且将5μL稀释液加入到细胞中。使用仅包含细胞培养基的对照孔进行基线校正。将细胞样品与SLT-1A::αHER2scFv、或仅与缓冲液在37℃在5%二氧化碳(CO2)的气氛中温育3天。使用发光细胞存活测定(Luminescent Cell Viability Assay,G7573 Promega Madison,WI,U.S.),按照供应商的使用说明,用发光读数确定总细胞存活或存活力百分数。使用下述方程计算实验孔的存活力百分数:(试验RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)中绘制对数多肽浓度相对于存活力百分数的图,并且利用log(抑制剂)相对于标准化的反应(可变斜率)分析确定SLT-1A::αHER2scFv的半最大细胞毒性浓度(CD50)值。

剂量依赖性实验确定,SLT-1A::αHER2scFv蛋白对HER2+细胞的CD50为约0.07nM(表6;图3)。测量以相反方向重组的相同蛋白结构域αHER2scFv::SLT-1A的CD50为约0.64nM(表6;图3)。针对HER2-细胞系MDA-MB468的结果是不明确的,原因在于对数据不能拟合适当的曲线。表6和图3的结果示例“改造的方形”对细胞毒性的影响。基于关于核糖体失活或靶细胞结合特征的体外结果,不能预测这些细胞毒性蛋白在细胞杀伤方面的差异。

表6.改造方向影响细胞毒性:与反方向αHER2scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αHER2scFv的代表性半最大细胞毒性浓度(CD50)

使用免疫荧光确定SLT-1A::αCDHER2scFv及其反方向αHER2scFv::SLT-1A的细胞内在化

使用本领域已知的标准免疫细胞化学技术研究细胞毒性蛋白进入靶细胞的能力。简言之,收集0.8x 106个每种细胞型(SKBR3(HER2+)和MDA-MB-231(HER2-))的细胞,并且悬浮在50μL包含蛋白酶抑制剂混合物(例如P1860 Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,U.S.)和人Fc受体蛋白(以减少非特异性免疫荧光染色)的细胞培养基中。然后,将100nM待分析的细胞毒性蛋白加入到细胞中,并且将所述细胞在37℃温育1小时,以允许进行中毒。然后,使用Cytofix/CytopermTM试剂盒(BD Biosciences San Diego,CA,U.S.)按照供应商的使用说明,将细胞“固定”并“渗透化”。志贺毒素效应子区用小鼠单克隆抗体(小鼠IgG抗-志贺毒素1亚基A,BEI NR-867 BEI Resources,Manassas,VA,U.S.)“染色”。然后用Alexa555单克隆抗体标记试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA,U.S.)按照供应商的使用说明检测该小鼠单克隆抗体的定位。

在该测定中,在HER2+细胞中,观察到针对SLT-1A::αHER2scFv和反方向蛋白αHER2scFv::SLT-1A二者的细胞表面结合和细胞内在化(图4)。没有观察到任一种蛋白向HER2-细胞的细胞内在化。这表明这两种变体(它们仅在它们的免疫球蛋白型结合区和志贺毒素效应子区的相对顺序方面不同)之间的细胞毒性差异(表6;图3)可能与靶细胞结合和/或细胞进入的任何显著的变化无关。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白αHER2scFv::SLT-1A的体内作用

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白αHER2scFv::SLT-1A对HER2+赘生性细胞的体内作用。使用多种小鼠品系来检测在静脉内施用后细胞毒性蛋白对小鼠中异种移植的肿瘤的作用,所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达HER2)而产生。

实施例3.来源于志贺样毒素1的A亚基的CD19-靶向的细胞毒性蛋白(SLT-1A::αCD19scFv)

本实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD19scFv包含与能够以高亲和力结合CD19的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段,从而所述志贺毒素效应子区比CD19结合区更邻近所述细胞毒性蛋白的氨基端。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD19scFv的构建、产生和纯化

在该实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。获得编码SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等,Mol Cancer 9:28(2010)。免疫球蛋白型结合区αCD19scFv来源于单克隆抗体抗-CD194G7(Peipp M等,J Immunol Methods 285:265-80(2004)和其中的参考文献),使得产生具有通过本领域已知的接头隔开的两个免疫球蛋白可变区(VL,和VH)的单链可变片段(scFv)。

将结合区和志贺毒素效应子区连接在一起形成融合蛋白。在该实施例中,将编码来自SLT-1A的志贺毒素效应子区(SEQ ID NO:1的氨基酸1-251)的多核苷酸与编码接头(如来源于鼠IgG3分子的“鼠铰链”(或技术人员已知的其他接头))的多核苷酸符合阅读框地克隆,并且与编码包含SEQ ID NO:12的氨基酸269-516的免疫球蛋白型结合区αCD19scFv的多核苷酸符合阅读框地克隆。使用DNA 2.0,Inc.(Menlo Park,CA,U.S.)的服务,将编码本实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD19scFv的多核苷酸序列进行密码子优化,用以在大肠杆菌中有效的表达。

通过表达编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD19scFv(SEQ ID NO:12)的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αCD19scFv细胞毒性蛋白的表达使用本领域已知的细菌系统实现。

在通过大肠杆菌表达系统产生SLT-1A::αCD19scFv的该实施例中,使用标准五分时时彩方法将编码SLT-1A::αCD19scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1载体(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中,以产生与编码载体的氨基端内蛋白的多核苷酸序列符合阅读框连接的编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD19scFv的多核苷酸序列。通过Sanger测序(Functional Biosciences,Madison,WI,U.S.)验证质粒插入多核苷酸序列,并且将其转化到T7细胞(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中。产生SLT-1A::αCD19scFv蛋白,并且按照IMPACTTM(具有亲和性壳多糖结合标记的内蛋白介导的纯化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系统手册(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)进行纯化。纯化使用本领域已知的标准技术(诸如亲核层析)实现。

在体外确定SLT-1A::αCD19scFv针对真核细胞核糖体的半最大抑制浓度(IC50)

使用快速连接转录/翻译试剂盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit,L1170 Promega,Madison,WI,U.S.,以无细胞体外蛋白翻译测定,确定SLT-1A::αCD19scFv的核糖体灭活能力。所述试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA和Quick Master Mix。根据生产商的说明书准备核糖体活性反应,以产生“TNT”反应混合物。

在适当的缓冲液中制备一系列待测SLT-1A::αCD19scFv的10倍稀释液,并且为每个SLT-1A::αCD19scFv稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物组分。将在SLT-1A::αCD19scFv蛋白稀释系列中的每个样品与TNT反应混合物中的每一个以及荧光素酶T7对照DNA合并。将试验样品在30℃温育1.5小时。在温育之后,将荧光素酶测定试剂(E1483 Promega,Madison,WI,U.S.)加入到所有试验样品中,并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。通过总蛋白的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线性回归分析,确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.),计算每个样品的半最大抑制浓度(ICa0)值。

SLT-1A::αCD19scFv对无细胞的蛋白合成的抑制作用强。剂量依赖性实验确定在该无细胞测定中SLT-1A::αCD19scFv对蛋白合成的IC50为约5.2pM(表7)。这一结果与关于反方向蛋白αCD19scFv::SLT-1A的IC50没有实质不同,测量反方向蛋白αCD19scFv::SLT-1A的IC50为约3.2pM或与仅有SLT-1A的阳性对照同等(表7)。这表明“改造的方向”作用可能与志贺毒素A亚基酶活性的任何明显的干扰无关。

表7.改造方向对核糖体失活没有影响:与反方向αCD19scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αCD19scFv的代表性半最大抑制浓度(IC50)

使用细胞杀伤测定确定SLT-1A::αCD19scFv的选择性细胞毒性和半最大细胞毒性浓度(CD50)

通过下述细胞杀伤测定确定SLT-1A::αCD19scFv的细胞毒性特征。该测定确定细胞毒性蛋白杀伤表达其免疫球蛋白型结合区的靶标生物分子的细胞的能力(与不表达所述靶标生物分子的细胞相比)。将细胞接种在384孔平板的20μL细胞培养基中(2x 103个细胞/孔)。将SLT-1A::αCD19scFv蛋白在缓冲液中稀释10倍,并且将5μL稀释液加入到细胞中。使用仅包含细胞培养基的对照孔进行基线校正。将细胞样品与SLT-1A::αCD19scFv、或仅与缓冲液在37℃在5%CO2气氛中温育3天。使用发光细胞存活测定(Luminescent Cell Viability Assay,G7573 Promega Madison,WI,U.S.),按照供应商的使用说明,用发光读数确定总细胞存活或存活力百分数。使用下述方程计算实验孔的存活力百分数:(试验RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)中绘制对数多肽浓度相对于存活力百分数的图,并且利用log(抑制剂)相对于反应(三个参数)分析确定SLT-1A::αCD19scFv的半最大细胞毒性浓度(CD50)值。

剂量依赖性实验确定,SLT-1A::αCD19scFv蛋白对CD19+Daudi细胞的CD50为约0.28nM(表8;图5)。基于曲线的形状,不能准确测量仅有SLT-1A的阴性对照和以反方向重组的相同蛋白结构域αCD19scFv::SLT-1A的CD50。由于曲线的形状,不能计算SLT-1A::αCD19scFv针对CD19阴性U266细胞的CD50;这些细胞不与细胞外靶标生物分子CD19物理连接。这些结果表明,蛋白改造的特定方向(其中,相对于所述志贺毒素效应子区,所述免疫球蛋白型区域不邻近细胞毒性蛋白的氨基端)赋予针对CD19+细胞的细胞毒性的改善(表8;图5)。基于关于核糖体失活的体外结果,不能预测这些细胞毒性蛋白的细胞杀伤的差异,并且预测基于靶细胞结合特征也不能预测这些细胞毒性蛋白的细胞杀伤的差异。

表8.改造的方向影响细胞毒性:与反方向αCD19scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αCD19scFv的代表性半最大细胞毒性浓度(CD50)

*“NC”表示不能计算。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD19scFv的体内作用

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD19scFv对赘生性细胞和/或免疫细胞的体内作用。使用多种小鼠品系来检测在静脉内施用后细胞毒性蛋白对小鼠中异种移植的肿瘤的作用,所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞和/或人免疫细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达CD19)而产生。

实施例4.来源于志贺样毒素1的A亚基的CD74-靶向的细胞毒性蛋白(SLT-1A::αCD74scFv)

该实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD74scFv包含与能够以高亲和力结合CD74的单链可变片段结合区重组的志贺毒素A亚基片段,使得所述志贺毒素效应子区比CD74结合区更邻近所述细胞毒性蛋白的氨基端。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD74scFv的构建、产生和纯化

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。获得编码SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等,Mol Cancer 9:28(2010))。免疫球蛋白型结合区αCD74scFv来源于人单克隆抗体抗-CD74,米拉珠单抗(Milatuzumab)(Sapra P等,Clin Cancer Res 11:5257-64(2005)和其中的参考文献),使得产生具有由本领域已知的接头隔开的两个免疫球蛋白可变区(VL和VH)的单链可变片段(scFv)。

将结合区和志贺毒素效应子区连接在一起形成融合蛋白。在该实施例中,将编码来自SLT-1A的志贺毒素效应子区(SEQ ID NO:1的氨基酸1-251)的多核苷酸与编码接头(如来源于鼠IgG3分子的“鼠铰链”(或技术人员已知的其他接头))的多核苷酸符合阅读框地克隆,并且与编码包含SEQ ID NO:16的氨基酸269-518的免疫球蛋白型结合区αCD74scFv的多核苷酸符合阅读框地克隆。使用DNA 2.0,Inc.(Menlo Park,CA,U.S.)的服务,将编码本实施例的细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD74scFv的多核苷酸序列进行密码子优化,用以在大肠杆菌中有效的表达。

通过表达编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD74scFv(SEQ ID NO:16)的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αCD74scFv细胞毒性蛋白的表达使用本领域已知的细菌系统实现。

在通过大肠杆菌表达系统产生SLT-1A::αCD74scFv的该实施例中,使用标准五分时时彩方法将编码SLT-1A::αCD74scFv的多核苷酸“插入”序列克隆到pTxb1载体(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中,以产生与编码载体的氨基端内蛋白的多核苷酸序列符合阅读框连接的编码细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD74scFv的多核苷酸序列。通过Sanger测序(Functional Biosciences,Madison,WI,U.S.)验证质粒插入多核苷酸序列,并且将其转化到T7细胞(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)中。产生SLT-1A::αCD74scFv蛋白,并且按照IMPACTTM(具有亲和性壳多糖结合标记的内蛋白介导的纯化(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag))系统手册(New England Biolabs,Ipswich,MA,U.S.)进行纯化。纯化使用本领域已知的标准技术(如亲和层析)实现。

在体外确定SLT-1A::αCD74scFv针对真核细胞核糖体的半最大抑制浓度(IC50)

使用快速连接转录/翻译试剂盒(Quick Coupled Transcription/Translation Kit,L1170 Promega,Madison,WI,U.S.,以无细胞体外蛋白翻译测定,确定SLT-1A::αCD74scFv的核糖体灭活能力。所述试剂盒包括荧光素酶T7对照DNA和Quick Master Mix。根据生产商的说明书准备核糖体活性反应,以产生“TNT”反应混合物。

在适当的缓冲液中制备一系列待测SLT-1A::αCD74scFv的10倍稀释液,并且为每个SLT-1A::αCD74scFv稀释液产生一系列相同的TNT反应混合物组分。将在SLT-1A::αCD74scFv蛋白稀释系列中的每个样品与TNT反应混合物中的每一个以及荧光素酶T7对照DNA合并。将试验样品在30℃温育1.5小时。在温育之后,将荧光素酶测定试剂(E1483 Promega,Madison,WI,U.S.)加入到所有试验样品中,并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。通过总蛋白的对数转化浓度相对于相对发光单位的非线性回归分析,确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.),计算每个样品的半最大抑制浓度(IC50)值。

SLT-1A::αCD74scFv对无细胞的蛋白合成的抑制作用强。剂量依赖性实验确定在该无细胞测定中SLT-1A::αCD74scFv对蛋白合成的IC50为约8.7pM(表9)。这一结果与关于反方向蛋白αCD74scFv::SLT-1A的IC50没有实质不同,测量反方向蛋白αCD74scFv::SLT-1A的IC50为约3.6pM或与仅有SLT-1A的阳性对照同等(表9)。这表明“改造的方向”作用可能与志贺毒素A亚基酶活性的任何明显的干扰无关。

表9.改造方向对核糖体失活没有影响:与反方向αCD74scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αCD74scFv的代表性相对半最大抑制浓度(IC50)

使用细胞杀伤测定确定SLT-1A::αCD74scFv的选择性细胞毒性和半最大细胞毒性浓度(CD50)

通过下述细胞杀伤测定确定SLT-1A::αCD74scFv的细胞毒性特征。该测定确定细胞毒性蛋白杀伤表达其免疫球蛋白型结合区的靶标生物分子的细胞的能力(与不具有所述结合区的SLT-1A蛋白相比)。将细胞接种在384孔平板的20μL细胞培养基中(2x 103个细胞/孔)。将SLT-1A::αCD74scFv蛋白在缓冲液中稀释10倍,并且将5μL稀释液加入到细胞中。使用仅包含细胞培养基的对照孔进行基线校正。将细胞样品与SLT-1A::αCD74scFv、或仅与缓冲液在37℃在5%CO2的气氛中温育3天。使用发光细胞存活测定(Luminescent Cell Viability Assay,G7573 Promega Madison,WI,U.S.),按照供应商的使用说明,用发光读数确定总细胞存活或存活力百分数。使用下述方程计算实验孔的存活力百分数:(试验RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism,San Diego,CA,U.S.)中绘制对数多肽浓度相对于存活力百分数的图,并且利用log(抑制剂)相对于反应(三个参数)分析确定SLT-1A::αCD74scFv的半最大细胞毒性浓度(CD50)值。

剂量依赖性实验确定,SLT-1A::αCD74scFv蛋白对CD74+Daudi细胞的CD50为约18.7nM(表10;图6)。仅有SLT-1A的阴性对照的CD50为2026nM,并且以反方向重组的相同蛋白结构域αCD74scFv::SLT-1A为95.3nM(表10;图6)。这表明,细胞毒性蛋白改造的一种特定的方向(其中,相对于所述志贺毒素效应子区,免疫球蛋白型区域不邻近细胞毒性蛋白的氨基端)赋予针对CD74+细胞的细胞毒性的改善。基于关于蛋白合成抑制的体外结果,不能预测这些细胞毒性蛋白的细胞杀伤方面的差异,并且预测基于靶细胞结合特征也不能预测这些细胞毒性蛋白的细胞杀伤方面的差异。

表10.改造方向影响细胞毒性:与反方向αCD74scFv::SLT-1A相比,SLT-1A::αCD74scFv的代表性半最大细胞毒性浓度(CD50)

使用动物模型确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD74scFv的体内作用

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCD74scFv对CD74+赘生性细胞和/或免疫细胞的体内作用。使用多种小鼠品系来检测在静脉内施用后细胞毒性蛋白对小鼠中异种移植的肿瘤的作用,所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞和/或免疫细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达CD74)而产生。

概述

当检测四种不同的细胞毒性蛋白(它们由志贺毒素亚基A来源的区域和在它们的氨基端的免疫球蛋白来源的靶向区构成)时,这些蛋白不表现出由它们的体外核糖体失活和/或靶向结合特征预测的预期的细胞毒性。令人惊讶地,观察到,与以相反的方向连接的相同的这两个多肽区域相比,将异源结合区邻近包含志贺毒素效应子区的蛋白融合体的氨基端连接没有导致有效的细胞毒性。

实施例5.来源于志贺样毒素1的A亚基和抗体αEB抗原的细胞毒性蛋白

在该实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区αEB抗原来源于针对EB抗原的单克隆抗体(Fang C等,J Immunol Methods 287:21-30(2004)),其包含能够结合感染了EB病毒的人细胞或表达EB抗原的转化细胞的免疫球蛋白型结合区。EB抗原表达在多种细胞型上,诸如感染了EB病毒的细胞和癌细胞(例如,淋巴瘤和鼻咽癌(naspharnygeal cancer)细胞)。另外,EB感染与其他疾病相关,例如,与多发性硬化相关。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αEB的构建、产生和纯化

将免疫球蛋白型结合区αEB抗原和志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白,其中,与所述志贺毒素效应子区相比,所述免疫球蛋白型结合区不邻近该蛋白的氨基端。例如,通过表达编码αEB抗原结合蛋白SLT-1A::αEB的多核苷产生融合蛋白。SLT-1A::αEB细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEB的体外特征

通过如上面在前述实施例中所述的基于荧光的流式细胞计量术测定,确定了本实施例的细胞毒性蛋白对EB抗原阳性细胞和EB抗原阴性细胞的结合特征。SLT-1A::αEB对EB抗原阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,具有在0.01-100nM的范围内的KD,而在该测定中不存在与EB抗原阴性细胞的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::αEB细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A::αEB对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEB的细胞毒性

通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀死测定使用EB抗原阳性细胞确定SLT-1A::αEB的细胞毒性特征。另外,通过相同的一般细胞杀死测定,使用EB抗原阴性细胞作为EB抗原阳性细胞的对比,确定SLT-1A::αEB的选择性细胞毒性特征。对于EB抗原阳性细胞(取决于细胞系),本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性蛋白对于不在细胞表面上表达EB抗原的细胞的CD50是在细胞表面上表达EB抗原的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEB的体内效应

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEB对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性蛋白在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植的肿瘤的效应,所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达EB抗原)而产生。

实施例6.来源于志贺样毒素1的A亚基和抗体α利什曼原虫抗原的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区α利什曼原虫抗原来源于使用本领域已知的技术制备的抗体,所述抗体针对存在于携带细胞内锥虫原生动物的人细胞上的细胞表面利什曼原虫抗原(参见Silveira T等,Int J Parasitol 31:1451-8(2001);Kenner J等,J Cutan Pathol 26:130-6(1999);Berman J and Dwyer,Clin Exp Immunol 44:342-348(1981))。

细胞毒性蛋白SLT-1A::α利什曼原虫的构建、产生和纯化

将免疫球蛋白型结合区α利什曼原虫抗原和志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白,其中,与所述志贺毒素效应子区相比,所述免疫球蛋白型结合区不邻近该蛋白的氨基端。例如,通过表达编码利什曼原虫抗原结合蛋白SLT-1A::α利什曼原虫的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::α利什曼原虫细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α利什曼原虫的体外特征

通过如上面在前述实施例中所述的基于荧光的流式细胞计量术测定,确定了本实施例的细胞毒性蛋白对利什曼原虫抗原阳性细胞和利什曼原虫抗原阴性细胞的结合特征。SLT-1A::α利什曼原虫对利什曼原虫抗原阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,具有在0.01-100nM的范围内的KD,而在该测定中不存在与利什曼原虫抗原阴性细胞的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::α利什曼原虫细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A::α利什曼原虫对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α利什曼原虫的细胞毒性

通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀死测定使用利什曼原虫抗原阳性细胞确定SLT-1A::α利什曼原虫的细胞毒性特征。另外,通过相同的一般细胞杀死测定,使用利什曼原虫抗原阴性细胞作为利什曼原虫抗原阳性细胞的对比,确定SLT-1A::α利什曼原虫的选择性细胞毒性特征。对于利什曼原虫抗原阳性细胞(取决于细胞系),本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性蛋白对于不在细胞表面上表达利什曼原虫抗原的细胞的CD50是在细胞表面上表达利什曼原虫抗原的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。

实施例7.来源于志贺样毒素1的A亚基和免疫球蛋白型结合区α神经降压肽受体的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区α神经降压肽受体来源于DARPinTM(GenBank登记号:2P2C_R)或结合人神经降压肽受体的单克隆抗体(Ovigne J等,Neuropeptides 32:247-56(1998))。神经降压肽受体由多种癌细胞表达,诸如乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑素瘤和胰腺癌细胞。

细胞毒性蛋白SLT-1A::α神经降压肽R的构建、产生和纯化

将免疫球蛋白型结合区α神经降压肽R和志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白,其中,与所述志贺毒素效应子区相比,所述免疫球蛋白型结合区不邻近该蛋白的氨基端。例如,通过表达编码神经降压肽受体结合蛋白SLT-1A::α神经降压肽R的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::α神经降压肽R细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α神经降压肽R的体外特征

通过如上面在前述实施例中所述的基于荧光的流式细胞计量术测定,确定了本实施例的细胞毒性蛋白对神经降压肽受体阳性细胞和神经降压肽受体阴性细胞的结合特征。SLT-1A::α神经降压肽R对神经降压肽受体阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,具有在0.01-100nM的范围内的KD,而在该测定中不存在与神经降压肽受体阴性细胞的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::α神经降压肽R细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A::α神经降压肽R对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α神经降压肽R的细胞毒性

通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀死测定使用神经降压肽受体阳性细胞确定SLT-1A::α神经降压肽R的细胞毒性特征。另外,通过相同的一般细胞杀死测定,使用神经降压肽受体阴性细胞作为神经降压肽受体阳性细胞的对比,确定SLT-1A::α神经降压肽R的选择性细胞毒性特征。对于神经降压肽受体阳性细胞(取决于细胞系),本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性蛋白对于不在细胞表面上表达神经降压肽受体的细胞的CD50是在细胞表面上表达神经降压肽受体的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α神经降压肽R的体内效应

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α神经降压肽R对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性蛋白在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植的肿瘤的效应,所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达神经降压肽受体)而产生。

实施例8.来源于志贺样毒素1的A亚基和免疫球蛋白型结合区αEGFR的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区αEGFR来源于AdNectinTM(GenBank登记号:3QWQ_B)、AffibodyTM(GenBank登记号:2KZI_A;美国专利8,598,113)或抗体,它们都与一种或多种人表皮生长因子受体结合。表皮生长因子受体的表达与人癌细胞相关,诸如,例如,肺癌细胞、乳腺癌细胞和结肠癌细胞。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αEGFR的构建、产生和纯化

将免疫球蛋白型结合区αEGFR与志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白,其中,与所述志贺毒素效应子区相比,所述免疫球蛋白型结合区不邻近该蛋白的氨基端。例如,通过表达编码EGFR结合蛋白SLT-1A::αEGFR的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αEGFR细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEGFR的体外特征

通过如上面在前述实施例中所述的基于荧光的流式细胞计量术测定,确定了本实施例的细胞毒性蛋白对EGFR+细胞和EGFR-细胞的结合特征。SLT-1A::aEGFR对EGFR+细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,具有在0.01-100nM的范围内的KD,而在该测定中不存在与EGFR-细胞的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::αEGFR细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A::αEGFR对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEGFR的细胞毒性

通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀死测定使用EGFR+细胞确定SLT-1A::αEGFR的细胞毒性特征。另外,通过相同的一般细胞杀死测定,使用利EGFR-细胞作为利什曼原虫抗原阳性细胞的对比,确定SLT-1A::αEGFR的选择性细胞毒性特征。对于EGFR+细胞(取决于细胞系),本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性蛋白对于不在细胞表面上表达EGFR的细胞的CD50是在细胞表面上表达EGFR的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEGFR的体内效应

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEGFR对赘生性细胞的体内效应。使用多个小鼠品系试验细胞毒性蛋白在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植的肿瘤的效应,所述小鼠中的异种移植的肿瘤通过向这些小鼠注射人赘生性细胞(所述细胞在它们细胞表面上表达EGFR(s))而产生。

实施例9.来源于志贺样毒素1的A亚基和抗体αCCR5的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区αCCR5来源于针对人CCR5(CD195)的单克隆抗体(Bernstone L等,Hybridoma 31:7-19(2012))。CCR5主要在T细胞、巨噬细胞、树突细胞和小胶质细胞上表达。另外,CCR5在人免疫缺陷病毒(HIV)的发病机制和传播中起作用。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αCCR5的构建、产生和纯化

将免疫球蛋白型结合区αCCR5与志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白,其中,与所述志贺毒素效应子区相比,所述免疫球蛋白型结合区不邻近该蛋白的氨基端。例如,通过表达编码αCCR5-结合蛋白SLT-1A::αCCR5的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αCCR5细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCCR5的体外特征

通过如上面在前述实施例中所述的基于荧光的流式细胞计量术测定,确定了本实施例的细胞毒性蛋白对CCR5+细胞和CCR5-细胞的结合特征。SLT-1A::αCCR5对CCR5+阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,具有在0.01-100nM的范围内的KD,而在该测定中不存在与CCR5-细胞的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::αCCR5细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。SLT-1A::αCCR5对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCCR5的细胞毒性

通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀死测定使用CCR5+细胞确定SLT-1A::αCCR5的细胞毒性特征。另外,通过相同的一般细胞杀死测定,使用CCR5-细胞作为CCR5+细胞的对比,确定SLT-1A::αCCR5的选择性细胞毒性特征。对于CCR5+细胞(取决于细胞系),本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性蛋白对于不在细胞表面上表达CCR5的细胞的CD50是在细胞表面上表达CCR5的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCCR5的体内效应

使用动物模型来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αCCR5对从耗尽来自供体物质的T细胞的体内效应(参见Tsirigotis P等,Immunotherapy 4:407-24(2012))。使用非人灵长动物确定SLT-1A::αCCR5的体内效应。当用SLT-1A::αCCR5预处理捐赠的器官时,在肾移植后,在恒河猴(rhesus macaques)中分析移植物抗宿主疾病(参见Weaver T等,Nat Med 15:746-9(2009))。在肠胃外施用不同剂量的SLT-1A::αCCR5以后,观察到食蟹猴灵长类动物中外周血T淋巴细胞的体内消耗。如下试验SLT-1A::αCCR5的阻断HIV感染的用途:给非人灵长类动物施用急性剂量的SLT-1A::αCCR5,以便在暴露于猿猴免疫缺陷病毒(SIV)时严格耗尽循环T-细胞(参见Sellier P等,PLoS One 5:e10570(2010))。

实施例10.来源于志贺毒素的A亚基和抗-Env免疫球蛋白结构域的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺毒素的A亚基(Stx-A)。免疫球蛋白型结合区αEnv来源于现有的结合HIV包膜糖蛋白免疫球蛋白型结合区αEnv的抗体,诸如GP41,GP120,GP140或GP160(参见,例如Chen W等,J Mol Bio 382:779-89(2008);Chen W等,Expert Opin Biol Ther 13:657-71(2013);van den Kerkhof T等,Retrovirology 10:102(2013),或来源于用标准技术产生的抗体(参见e Prabakaran等,Front Microbiol 3:277(2012))。Env是在HIV复制过程中也在被HIV-感染的细胞的细胞表面上展示的HIV表面蛋白。尽管Env在受感染的细胞中主要在胞内体区室中表达,足够量的Env可以存在于要被本发明的非常有效的细胞毒性蛋白靶向的细胞表面上。另外,靶向Env的细胞毒性蛋白可能结合HIV病毒粒子并在病毒粒子与宿主细胞的融合过程中进入新感染的细胞。

因为HIV表现出高突变率,优选的是使用结合Env的功能受限部分的免疫球蛋白结构域,诸如结合来自多个HIV毒株的Env的宽泛中和抗体所证实的(van den Kerkhof T等,Retrovirology 10:102(2013))。因为认为在受感染的细胞的表面上存在的Env呈递空间上受限的表位(Chen W等,J Virol 88:1125-39(2014)),优选的是,使用小于100kD且理想地小于25kD的结合区,诸如sdAb的片段,如VHH结构域。

细胞毒性蛋白αEnv::SLT-1A的构建、产生和纯合

将免疫球蛋白型结合区αEnv和志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白。例如,通过表达编码αEnv-结合蛋白SLT-1A::αEnv的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αEnv细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEnv的体外特征

通过如上面在前述实施例中所述的基于荧光的流式细胞计量术测定,确定了本实施例的细胞毒性蛋白对Env+细胞和Env-细胞的结合特征。SLT-1A::αEnv对Env+阳性细胞的Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,具有在0.01-100nM的范围内的KD,而在该测定中不存在与Env-细胞的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::αEnv细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。在该无细胞测定中SLT-1A::αEnv对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEnv的细胞毒性

通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀死测定使用Env+细胞确定SLT-1A::αEnv的细胞毒性特征。另外,通过相同的一般细胞杀死测定,使用利Env-细胞作为Env+细胞的对比,确定SLT-1A::αEnv的选择性细胞毒性特征。对于Env+细胞(取决于细胞系)和/或用于感染细胞使其成为Env+的HIV毒株,本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性蛋白对于不在细胞表面上表达Env的细胞的CD50是在细胞表面上表达Env的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。

使用动物模型确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αEnv的体内效应

通过向感染了猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的非人灵长动物施用SLT-1A::αEnv检测SLT-1A::αEnv抑制HIV感染的应用(参见Sellier P等,PLoS One 5:e10570(2010))。

实施例11.来源于志贺样毒素1的A亚基和抗体αUL18的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区αUL18来源于使用本领域已知的技术产生的针对细胞表面巨细胞病毒蛋白UL18的抗体,所述细胞表面巨细胞病毒蛋白UL18存在于感染了巨细胞病毒的人细胞上(Yang Z,Bjorkman P,Proc Natl Acad Sci USA 105:10095-100(2008))。人巨细胞病毒感染与多种癌症和炎性病症相关。

细胞毒性蛋白SLT-1A::αUL18的构建、产生和纯化

将免疫球蛋白型结合区αUL18与志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白,其中,与所述志贺毒素效应子区相比,所述免疫球蛋白型结合区不邻近该蛋白的氨基端。例如,通过表达编码αUL18-结合蛋白SLT-1A::αUL18的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::αUL18细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αUL18的体外特征

通过如上面在前述实施例中所述的基于荧光的流式细胞计量术测定,确定了本实施例的细胞毒性蛋白对巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞和巨细胞病毒蛋白UL18阴性细胞的结合特征。SLT-1A::αUL18对巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞Bmax被测量为大约50,000-200,000MFI,具有在0.01-100nM的范围内的KD,而在该测定中不存在与巨细胞病毒蛋白UL18阴性细胞的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::αUL18细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。SLT-1A::αUL18对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用细胞杀伤测定来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::αUL18的细胞毒性

通过如上面在前述实施例中所述的一般细胞杀死测定使用巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞确定SLT-1A::αUL18的细胞毒性特征。另外,通过相同的一般细胞杀死测定,使用巨细胞病毒蛋白UL18阴性细胞作为巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞的对比,确定SLT-1A::αUL18的选择性细胞毒性特征。对于巨细胞病毒蛋白UL18阳性细胞(取决于细胞系),本实施例的细胞毒性蛋白的CD50是大约0.01-100nM。所述细胞毒性蛋白对于不在细胞表面上表达巨细胞病毒蛋白UL18的细胞的CD50是在细胞表面上表达巨细胞病毒蛋白UL18的细胞的大约10-10,000倍(更少的细胞毒性)。

实施例12.来源于志贺样毒素1的A亚基和抗体α蠕虫肠道抗原的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。免疫球蛋白型结合区α蠕虫肠道抗原来源于使用本领域已知的技术产生的针对人转铁蛋白受体的蠕虫直向同系物的抗体(参见,例如线虫基因gcp-2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL;Rosa B等,Mol Cell Proteomics M114.046227(2015))。

细胞毒性蛋白SLT-1A::α蠕虫肠道抗原的构建、产生和纯化

将免疫球蛋白型结合区α蠕虫肠道抗原与志贺毒素效应子区连接在一起形成蛋白,其中,与所述志贺毒素效应子区相比,所述免疫球蛋白型结合区不邻近该蛋白的氨基端。例如,通过表达编码α蠕虫肠道抗原-结合蛋白SLT-1A::α蠕虫肠道抗原的多核苷酸产生融合蛋白。SLT-1A::α利什曼原虫细胞毒性蛋白的表达使用前面实施例所述的细菌和/或无细胞蛋白翻译系统实现。

确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α蠕虫肠道抗原的体外特征

通过本领域已知的分子结合测定,使用纯化的重组靶蛋白,确定了本实施例的细胞毒性蛋白的结合特征。SLT-SLT-1A::α蠕虫肠道抗原对靶蛋白的KD测量为大约100nM,而在该测定中不存在于阴性对照蛋白(例如,纯化的、重组的人转铁蛋白受体)的显著结合。

在如上面在前述实施例中所述的无细胞体外蛋白翻译中确定了SLT-1A::α蠕虫肠道抗原细胞毒性蛋白的核糖体灭活能力。本实施例的细胞毒性蛋白对无细胞蛋白合成的抑制作用是显著的。SLT-1A::α蠕虫肠道抗原对蛋白合成的IC50是大约0.1-100pM。

使用蠕虫来确定细胞毒性蛋白SLT-1A::α蠕虫肠道抗原的毒性

使用模式蠕虫确定SLT-1A::α蠕虫肠道抗原对蠕虫的毒性(参见,例如Iatsenko I等,Toxins 2050-63(2014))。可以通过浸没向蠕虫施用纯化的SLT-1A::α蠕虫肠道抗原,或备选地通过用表达SLT-1A::α蠕虫肠道抗原融合蛋白的细菌喂养蠕虫而施用。

另外,向携带蠕虫和/或展示蠕虫相关疾病的实验室动物施用SLT-1A::α蠕虫肠道抗原,并且检测其蠕虫和/或寄生的蠕虫的相关症状的减少或消除。

实施例13.靶向不同细胞型的细胞毒性蛋白

在本实施例中,志贺毒素效应子区来源于志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)、志贺毒素的A亚基(StxA)和/或志贺样毒素2的A亚基(SLT-2A)。免疫球蛋白型结合区来源于这样的免疫球蛋白结构域:其来自选自表11的第1列的分子,且其结合在表11的第2列中指示的细胞外靶标生物分子。使用本领域已知的技术,产生具有邻近氨基端的志贺毒素效应子区的该实施例的示例性细胞毒性蛋白,并且任选地连接检测促进剂。如在前述实施例中所述,使用表达适当的细胞外靶标生物分子的细胞,产生并检测本实施例的示例性细胞毒性蛋白。例如,可以使用本实施例的示例性蛋白诊断和治疗在表11的第3列中所示的疾病、病患和/或病症。

表11.细胞毒性蛋白用于细胞靶向的不同免疫球蛋白型结合区

尽管已经通过举例说明的方式描述了本发明的一些实施方案,显而易见,可以利用许多修改、变化和改编以及利用在本领域技术人员范围内的众多等同或替代方案实施本发明,而不背离本发明的精神或超出权利要求的范围。

所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文,达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入的程度。国际专利申请公布WO 2014164680 A1和WO 2014164693 A2通过引用完全结合在本文中。美国临时专利申请61/951,110、61/951,121和62/010,918的公开内容各自通过引用整体并入本文。国际PCT专利申请系列PCT/US2014/023,198、PCT/US2014/023,231、PCT/US2015/012,968、PCT/US2015/012,970和PCT/US2015/14,472的公开内容各自通过引用整体并入本文。关于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的来自GenBank(国家生物技术信息中心,美国)的所有可电子获得的生物序列信息的完整公开内容各自通过引用整体并入本文。

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