ε-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺-β环糊精聚合物及其制备五分时时彩方法和应用

文档序号:10482928
ε-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺-β环糊精聚合物及其制备五分时时彩方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种ε?聚赖氨酸?聚乙烯亚胺?β环糊精聚合物及其制备五分时时彩方法,用ε?聚赖氨酸为主链,将其改性后与枝接了β环糊精的聚乙烯亚胺进行偶联,最终得到ε?聚赖氨酸?聚乙烯亚胺?β环糊精聚合物;本发明所述ε?聚赖氨酸?聚乙烯亚胺?β环糊精聚合物,其中β环糊精的空腔可以包合一些水溶性差的药物形成包合物,以增加药物的水溶性;另外,载体中的聚乙烯亚胺,可与外源DNA凝聚形成纳米粒,以进行基因转染,该新型聚合物在药物载体和基因载体等领域均有很高的应用潜能。
【专利说明】
ε-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺-β环糊精聚合物及其制备五分时时彩方法和 应用
技术领域
[0001] 本发明属于药用超分子载体的制备五分时时彩方法领域,具体涉及一种以水溶性很好的聚乙 烯亚胺β环糊精与Ν-琥珀酰聚赖氨酸为原料,通过酰胺缩合构筑一种水溶性极佳的新型ε- 聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物的五分时时彩方法。
【背景技术】
[0002] 近些年来,高分子聚合物如微粒或纳米粒,作为一种新的药物载体引起了广泛的 兴趣。通过共聚物上的疏水基团或亲水基团间的相互作用或带相反电荷的分子间的相互作 用可以形成一种新的微型或纳米胶自组装体。这些药物载体可以与许多具有生物活性的分 子相互作用,如抗癌药物分子、酶、蛋白类等。
[0003] ε-聚赖氨酸是一种生物合成的非核糖体赖氨酸聚合物,含有25~35个赖氨酸单体, 且每个赖氨酸单元通过氨基和羧基之间的肽键进行连接,分子量约为3500~4500,具有良 好的安全性、抑菌性能和热稳定性。ε_聚赖氨酸富含阳离子,与带有阴离子的物质有强的静 电作用力并且对生物膜有良好的穿透力。基于以上特性,ε_聚赖氨酸可用于药物载体,在材 料科学和医药卫生领域得到广泛应用。
[0004] 聚乙稀亚胺(polyethylenimine, ΡΕΙ),是一种很常用的聚阳离子材料。聚阳离子 材料,如:聚乙稀亚胺(polyethy lenimine,PEI )、壳聚糖(chi tosan)、树枝状聚合物 (dendrimer)以及其它聚阳离子衍生物,是一类典型的非病毒性基因载体。而聚乙烯亚胺的 作用尤为突出,其在体外和体内实验中均表现出很高的基因转染效率。聚乙烯亚胺结构中 的-NH2具有很强的DNA结合作用,而-NH-和=N-被质子化后,具有很强的缓冲作用,能保护 DNA在细胞溶酶体中不被核酸酶降解,促进DNA从内含体中逃逸。聚乙烯亚胺的基因转染效 率与其分子量、表面电荷及缓冲能力有十分密切的关系。高分子量的聚乙烯亚胺(大于 25KDa)转染效率很高,但毒性也大,不能被生物降解以及在体内滞留时间较长;低分子量的 聚乙烯亚胺毒性低,同时基因转染效率也低,因此不能单独作为基因药物的载体。
[0005] 环糊精(cyclodextrin)又名环链淀粉,是6~8个D-葡萄糖分子通过α-l,4-糖苷键 连接,互为椅式构象的环状化合物。由六分子D-葡萄糖所组成者称为α-环糊精,由七分子D- 葡萄糖所组成者称为环糊精,由八分子D-葡萄糖所组成者称为γ -环糊精。环糊精分子呈 环形圆筒状,外表面亲水而内腔疏水。环糊精的疏水内腔可与一些空间匹配的分子形成包 合物,从而对这种被包合的分子进行改性,如提高稳定性以及水溶性。由于环糊精的这种性 质,它被越来越多的利用在生物医药领域。
[0006] ε-聚赖氨酸与环糊精共同构筑超分子聚合物载体是现今的一个研究热点,之前已 经有一些文献进行报道(① Kang Μ Η. Rapid Commun, 2002,23: 179-182.② Hak S C. Macromolecules, 2003, 36: 5342-5347.③ Wei H L. Macromolecules, 2005, 38: 8833-8899.).这些报道中通过ε-聚赖氨酸与环糊精及其衍生物直接进行接枝,但没有通过 琥珀酸和聚乙烯亚胺进行连接的聚合物的报道。

【发明内容】

[0007] 本发明目的是提供一种水溶性极佳、稳定性极佳、没有毒副作用的新型ε-聚赖氨 酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物的制备五分时时彩方法。该聚合物由Ν-琥珀酰聚赖氨酸通过自身游离 的羧基,在缩合剂和缩合辅助剂作用下,与β环糊精修饰的聚乙烯亚胺上任意一个伯胺基发 生酰胺化反应而得到。
[0008] 本发明得到的新型ε-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺4环糊精聚合物是一种水溶性极好的 药物/基因载体,它利用环糊精憎水性内腔可与一些空间匹配的药物形成包合物,从而对这 种被包合的药物进行改性,提高药物的稳定性以及水溶性。现在市面上有许多活性化合物 具有不错的疗效,但是由于本身水溶性或稳定性欠佳的原因,很难单独成药,例如抗癌药物 阿霉素、青蒿琥酯、双氢青篙素、灯盏花乙素以及5-氟尿嘧啶。由于载体上接枝了聚乙烯亚 胺,对DNA有很强的凝聚作用,可以形成纳米粒,故也可以作为基因载体。本发明旨在得到一 种水溶性极佳、稳定性极佳、没有毒副作用的药物/基因载体。
[0009] 本发明聚合物具体制备过程如下: (1) 将琥泊酸酐和分子量在3500~4500范围的聚赖氨酸在二甲基亚砜中于50 °C下反应5 天得到N-琥珀酰聚赖氨酸;(具体五分时时彩方法参见杨波等.一种新型ε-聚赖氨酸的制备五分时时彩方法[P]. 中国:CN 103483583 A.2014-01-01); (2) 将6-对甲苯磺酰-β环糊精与不同分子量的聚乙烯亚胺在二甲基亚砜中于80°C下反 应3天得不同分子量的聚乙稀亚胺-β环糊精(五分时时彩方法参见Yuan P. Biomaterials 32 (2011) 8328-8341); (3) 将N-琥珀酰聚赖氨酸添加到强极性溶剂中,然后在缩合剂和缩合辅助剂作用下, 于-4~25 °C条件下反应15~120min,其中N-琥珀酰聚赖氨酸在溶剂中的浓度为0.001~0.0025 mol/L,缩合剂与N-琥珀酰聚赖氨酸的摩尔比为25~35:1,缩合辅助剂与N-琥珀酰聚赖氨酸 的摩尔比为8~35:1;在所制得的混合液中加入聚乙烯亚胺环糊精于25~60 °C下反应2~5d, 其中聚乙烯亚胺环糊精与N-琥珀酰聚赖氨酸的摩尔比为20~35:1;反应完毕后,经透析后蒸 干制得产物。
[0010] 本发明中所述的强极性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或混合溶剂(N,N- 二甲基甲酰胺和二甲基亚砜按1:10~1:5体积比混合)。反应溶剂优选二甲基亚砜,通过实验 筛选,N-琥珀酰聚赖氨酸在溶剂中的浓度为0.001~0.002 mol/L,可得到满意的接枝率。
[0011] 本发明中所用的缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己 基二亚胺、N,N'-羰基二咪唑中的一种,且缩合剂与N-琥珀酰聚赖氨酸的摩尔比为25~35:1。 因为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐要求的条件温和且缩合效果高于其余两 种,所以优选它。通过实验筛选,缩合剂与N-琥珀酰聚赖氨酸的摩尔比优选为25~27:1;所用 的缩合辅助剂为4-二甲氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑,且缩合辅助剂与 N-琥珀酰聚赖氨酸的摩尔比为8~35:1,通过实验筛选,缩合辅助剂与N-琥珀酰聚赖氨酸的 摩尔比优选为15~27:1。
[0012] 本发明所述N-琥珀酰聚赖氨酸与缩合剂和缩合辅助剂反应是在-4~25°C条件下反 应15~120min,优选0~5 °C条件下反应60~90min。
[0013] 本发明中所用的聚乙稀亚胺分子量为600~25000。
[0014]本发明所述的聚乙烯亚胺环糊精与N-琥珀酰聚赖氨酸在25~60 °C下反应2~5d,优 选在25~35°C下反应3~4d。其中聚乙烯亚胺环糊精与N-琥珀酰聚赖氨酸的摩尔比为20~35: 1,优选25~30:1。
[0015]本发明反应结构式如下:
兵屮n=莱乙輝置妝力、-TM/bUU,x俚刀0~丄4。
[0016]本发明另一目的是将ε-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺-β环糊精聚合物应用在DNA凝聚中。
[0017] 本发明的优点和效果如下: 本发明提供的新型ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺4环糊精聚合物是在Ν-琥珀酰聚赖氨酸上 接枝多个聚乙烯亚胺环糊精,有望作为一种水溶性极佳、稳定性极佳、没有毒副作用的药 物/基因载体。另一方面,本发明所述的新型ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物的制 备五分时时彩方法,操作简单,反应条件温和,所得产品收率高,接枝率高,纯度高,可用于工业化生产。
【附图说明】
[0018] 图1是Ν-琥珀酰聚赖氨酸的核磁共振氢谱(? NMR)图; 图2是聚乙烯亚胺(分子量600)β环糊精的核磁共振氢谱(? NMR)图; 图3是本发明中ε -聚赖氨酸-聚乙烯亚胺(分子量1800 )_?3环糊精聚合物的核磁共振氢 谱(? NMR)图; 图4是本发明中ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺(分子量10000)_β环糊精聚合物在不同浓度下 与大肠杆菌BL21 (DE3)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图; 图5是本发明中ε-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺(分子量1800)_β环糊精聚合物与大肠杆菌 BL21(DE3)质粒DNA的原子力显微镜图;其中a图是单纯的大肠杆菌BL21(DE3)质粒DNA原子 力显微镜图;b图为该聚合物和大肠杆菌BL21 (DE3)质粒DNA作用的原子力显微镜图。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合实施例对本发明进行详细的描述,但不限于实施例公开的内容。
[0020] 实施例1 :N-琥珀酰聚赖氨酸的制备 将5g (1.25mmol) ε-聚赖氨酸加入到100mL二甲基亚砜中在室温下搅拌均匀,往所制 得溶液中加入4.5g (45.Ommol)琥珀酸酐搅拌均匀并加热至50°C反应5d,反应结束静置冷 却后,将反应液滴入600mL丙酮中并搅拌,析出沉淀后抽滤,所得淡黄色固体即为N-琥珀酰 聚赖氨酸,收率为84%,接枝率为71.6%(图1)。
[0021]实施例2:不同分子量聚乙烯亚胺环糊精的制备 取0.75g (1.25mmol)分子量600的聚乙烯亚胺,2.25g( 1.25mmol)分子量1800的聚乙烯 亚胺,12.50g (1.25mmol)分子量10000的聚乙烯亚胺,31.25g (1.25mmol)分子量25000的 聚乙烯亚胺分别加入100mL二甲基亚砜中室温下搅拌均匀,往所制得溶液中分别加入1.61g (1.25mmol),4.83g (3.75mmol),26.73g (20.75mmol),67.14g (52.13mmol) 6_对甲苯横 酰-β-环糊精,搅拌均匀加热至80°C反应3d,反应结束静置冷却后,将反应液透析蒸干,所得 黄色固体即为聚乙烯亚胺-β环糊精,收率分别为75%,72%,81%,79%(图2 )。
[0022]实施例3: ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物得制备(聚乙烯亚胺分子量为 600) 将0.655g (0. lmmol )Ν-琥珀酰聚赖氨酸添加到100mL二甲基亚砜中,然后加入0.50g (2.6mmol)l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.23g(2mmol)N-羟基琥珀酰亚 胺,于〇°C下活化90min,在所制得的混合液中加入4.72g(2mmol)聚乙烯亚胺环糊精(聚乙 烯亚胺分子量为600)在30°C下反应4d。反应完毕后,经透析后蒸干制得产物,收率76.8%,接 枝率45.1%。
[0023]实施例4: ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物得制备(聚乙烯亚胺分子量为 1800) 将0.655g (0. lmmol )Ν-琥珀酰聚赖氨酸添加到100mL二甲基亚砜中,然后加入0.50g (2.6mmol)l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.23g(2mmol)N-羟基琥珀酰亚 胺,于〇 °C下活化90min,在所制得的混合液中加入14.16g( 2mmol)聚乙烯亚胺环糊精(聚 乙烯亚胺分子量为1800)在30°C下反应4d。反应完毕后,经透析后蒸干制得产物,收率 73.4%,接枝率 34.5%(图 3 )。
[0024]图5是ε-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺(分子量1800)_β环糊精聚合物与大肠杆菌BL21 (DE3)质粒DNA的原子力显微镜图,(a)是单纯的大肠杆菌BL21(DE3)质粒DNA原子力显微镜 图;(b)为该聚合物和大肠杆菌BL21 (DE3)质粒DNA作用的原子力显微镜图,图中表明:该聚 合物可以有效的将质粒DNA从松散的网状凝聚成粒径均一的聚集体。
[0025]实施例5: ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物得制备(聚乙烯亚胺分子量为 10000) 将0.066g (0.01 mmol )Ν-琥珀酰聚赖氨酸添加到10mL二甲基亚砜中,然后加入0.05g (0.26mmol)l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.023g(0.2mmol)N-羟基琥珀 酰亚胺,于〇°C下活化90min,在所制得的混合液中加入7.65g(0.2mmol)聚乙烯亚胺环糊 精(聚乙烯亚胺分子量为10000)在30°C下反应4d。反应完毕后,经透析后蒸干制得产物,收 率69%,接枝率29.3%。
[0026] 聚赖氨酸-聚乙烯亚胺(分子量10000)_β环糊精聚合物在不同浓度下与大肠杆 菌BL21 (DE3)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳实验 如图4所示,其中:泳道1为单独质粒DNA(0.5 yg/mL),泳道2为质粒DNA(0.5 ng/yL)+ PEI(分子量 10000)(2·5Χ10-4 mol/L),泳道3为质粒DNA(0.5 ng/yL)+聚合物(0.5X10-5 mol/L),泳道4为质粒DNA(0.5 ng/yLH聚合物(1.0 X 10-4 mol/L),泳道5为质粒DNA(0.5 ng/yL)+聚合物(2.0X10-4 mol/L),泳道6为质粒DNA(4.0 ng/yL)+聚合物(0.5X10-4mol/L),泳道7为质粒DNA(0.5 ng/yL)+聚合物(8.0X10-4 mol/L);从图中表明,该聚合物 在低浓度下能有效的凝聚DNA。
[0027]实施例6: ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物得制备(聚乙烯亚胺分子量为 25000) 将0.066g (0.01 mmol )Ν-琥珀酰聚赖氨酸添加到10mL二甲基亚砜中,然后加入0.05g (0.26mmol)l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.023g(0.2mmol)N-羟基琥珀 酰亚胺,于〇 °C下活化90min,在所制得的混合液中加入19.68g(0.2mmol)聚乙烯亚胺环糊精 (聚乙烯亚胺分子量为25000)在30°C下反应4d。反应完毕后,经透析后蒸干制得产物,收率 66.4%,接枝率18.9%。
[0028]实施例7: ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物得制备(聚乙烯亚胺分子量为 10000) 将O.Olmmol Ν-琥?白酰聚赖氨酸添加到5mL Ν,Ν-二甲基甲酰胺中,然后加入0.3mmol二 环己基二亚胺和0. lmmol 4-二甲氨基吡啶,于20°C下活化30min,在所制得的混合液中加入 0.25mmol聚乙烯亚胺环糊精(聚乙烯亚胺分子量为10000)在40°C下反应3d。反应完毕后, 经透析后蒸干制得产物,收率66%,接枝率25.8%。
[0029]实施例8: ε_聚赖氨酸-聚乙烯亚胺环糊精聚合物得制备(聚乙烯亚胺分子量为 600) 将0.0 lmmo 1 Ν-琥珀酰聚赖氨酸添加到7mL强极性非质子溶剂(Ν,Ν-二甲基甲酰胺和二 甲基亚砜按体积比1:10混合)中,然后加入0.35mmol N,N' -羰基二咪唑和0.3mmol 1-羟基 苯并三唑,于15°C下活化60min,在所制得的混合液中加入0.32mmol聚乙烯亚胺环糊精 (聚乙烯亚胺分子量为600)在60°C下反应2d。反应完毕后,经透析后蒸干制得产物,收率 74.4%,接枝率 43.2%。
【主权项】
1. 一种ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物,其结构式如下:其中η=聚乙締亚胺分子量/600,X值为6~14。2. 权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物的制备五分时时彩方法,其特征在于 按如下步骤进行: (1)将Ν-班巧酷聚赖氨酸添加到强极性非质子溶剂中,在缩合剂和缩合辅助剂作用下, 于-4~25 °C条件下反应15~120min,其中Ν-班巧酷聚赖氨酸在溶剂中的浓度为0.0(Π ~0.0025 mol/L,缩合剂与Ν-班巧酷聚赖氨酸的摩尔比为25~35:1,缩合辅助剂与Ν-班巧酷聚赖氨酸 的摩尔比为8~35:1; (2 )在步骤(1)的混合液中加入聚乙締亚胺-β环糊精于25~60°C下反应2~5天,其中聚乙 締亚胺-β环糊精与N-班巧酷聚赖氨酸的摩尔比为20~35:1; (3)反应完毕后,经透析后蒸干制得ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物。3. 根据权利要求2所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物的制备五分时时彩方法,其特征 在于:Ν-班巧酷聚赖氨酸是通过班巧酸酢和分子量为3500~4500的ε-聚赖氨酸在二甲基亚 讽中反应制得。4. 根据权利要求2所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物的制备五分时时彩方法,其特征 在于:强极性非质子溶剂为Ν,Ν-二甲基甲酯胺和/或二甲基亚讽。5. 根据权利要求4所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物的制备五分时时彩方法,其特征 在于:Ν,Ν-二甲基甲酯胺和二甲基亚讽按体积比1:10~1:5混合。6. 根据权利要求2所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物的制备五分时时彩方法,其特征 在于:缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、二环己基二亚胺、Ν,Ν'-幾基 二咪挫中的一种。7. 根据权利要求2所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物的制备五分时时彩方法,其特征 在于:缩合辅助剂为4-二甲氨基化晚、Ν-径基班巧酷亚胺或1-径基苯并Ξ挫。8. 根据权利要求2所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物的制备五分时时彩方法,其特征 在于:聚乙締亚胺-β环糊精的结构式如式I所示:其中n=聚乙締亚胺分子量/600。9.权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-聚乙締亚胺-β环糊精聚合物在DNA凝聚中的应用。
【文档编号】C12N15/87GK105837827SQ201610307704
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】杨波, 吕品, 廖荣强, 刘满朔, 廖霞俐, 高传柱, 赵榆林
【申请人】昆明理工大学
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