多诊断试剂盒的制作五分时时彩方法

文档序号:11249524
多诊断试剂盒的制造五分时时彩方法与工艺
本发明涉及多诊断试剂盒。
背景技术
:通常,用于诊断疾病如恙虫病、钩端螺旋体病和肾综合征出血热的技术主要以以下方式进行:将生物样品(如被怀疑感染了以上疾病的患者的血液或尿液)涂到诊断试纸条上并且检查其与所述试纸条上的固定物的反应,由此确定患者是否感染了以上疾病。然而,这类技术只可用于诊断单一疾病,为了检查多种疾病的感染,必须独立地进行各个测试并且必须注入多个生物样品,因此诊断过程非常复杂。技术实现要素:因此,考虑到相关技术中遇到的问题而做出了本发明,本发明旨在提供多诊断试剂盒,其可以快速且简单地诊断恙虫病、钩端螺旋体病和肾综合征出血热的感染。通过以下说明书,结合附图,将清楚地理解本发明。本发明的实施方案提供包括试纸条的多诊断试剂盒,所述试纸条包含恙虫抗原蛋白、钩端螺旋体抗原和肾综合征出血热抗原蛋白,所述恙虫抗原蛋白含有恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi)Gilliam、Karp和Kato的56kDa融合蛋白(cr56)和恙虫病东方体Kangwon的56kDa蛋白(kr56)。所述钩端螺旋体抗原可包含从钩端螺旋体的脂多糖(LPS)中制备的核心多糖和O-特异侧链。所述肾综合征出血热抗原蛋白可包含核壳体蛋白,所述核壳体蛋白是从Soochong病毒制备的并具有来自真核细胞的SEQIDNO:2或3的氨基酸序列。根据本发明的实施方案,多诊断试剂盒可检测恙虫病、钩端螺旋体病和肾综合征出血热的感染。所述多诊断试剂盒可通过单次注入生物样品而同时诊断多种疾病的感染。此外,所述多诊断试剂盒不包含任何非特异性抗体,从而确保高度精确的诊断结果。附图说明从以下的详细说明书并结合附图,将更清楚地理解本发明的上述以及其它特征和优点,其中:图1示出了本发明的实施方案的多诊断试剂盒;图2示出了本发明的实施方案的多诊断试剂盒的试纸条;图3示出了本发明的实施方案的依赖恙虫抗原蛋白浓度的试剂盒的反应;图4示出了本发明的实施方案的依赖恙虫抗原蛋白组成的试剂盒的反应;图5示出了纯化的多糖的抗原性,其是根据本发明的实施方案从patoc型和lai型中分离的多糖的SDS-PAGE(A)和蛋白质印迹法(B)的结果;图6示出了本发明的实施方案的核壳体蛋白(NP)、完整的NP(CNP)和截短的NP(CNP)在Soochong病毒的S区段的基因结构;图7示出了本发明的实施方案的聚合酶链反应(PCR)之后的TNP的DNA条带(约370bp)和CNP的DNA条带(约1300bp);图8示出了根据本发明的实施方案将TNP的DNA和CNP的DNA克隆到pGem-T-EasyPCR克隆载体中;图9示出了根据本发明的实施方案将pGT-SooV2-TNP和pGT-SooV2-CNP的PCR产物克隆到在N-末端具有His-Taq的杆状病毒质粒载体中;图10示出了根据本发明的实施方案使用杆状病毒表达载体系统从pBac-SooV2-TNP和pBac-SooV2-CNP形成Bac-SooV2-TNP和Bac-SooV2-CNP;图11示出了根据本发明的实施方案使用患者血清和正常血清检测TNP的蛋白质印迹法的结果;以及图12示出了本发明的实施方案的TNP和CNP的纯化的粒状沉淀(pellet)的蛋白质印迹法的结果。具体实施方式在下文中,将对本发明的实施方案进行详细描述。本发明不限于本文所公开的实施方案,而是可以被修改为不同形式。提供这些实施方案是为了详尽地解释本公开内容并将本发明的精神充分地传达给本领域技术人员。因此,所提出这些实施方案不应被理解为限制本发明。尽管术语如“第一”、“第二”等用于描述各种要素,但所述要素不应被此类术语所限制。这些术语仅用于将要素彼此区分。此外,当第一要素被描述为设置在第二要素上时,意味着第一要素可直接地形成于第二要素上,或在第一和第二要素之间可插入第三要素。在所有附图中,可能夸大地描绘要素的尺寸或要素的相对尺寸以提供对本发明的容易理解的描述。此外,由于制造五分时时彩方法的变化,附图中所示的要素的形状可稍微改变。因此,除非另有说明,应理解,本发明的实施方案并不仅限于附图中所示的形状,一些修改可并入其中。如本文所用,术语“恙虫病”是由恙虫病东方体引起的疾病。如本文所用,术语“钩端螺旋体病”是由钩端螺旋体属(Leptospira)的致病螺旋茵引起的疾病。如本文所用,术语“肾综合征出血热”是由汉他(Hantaan)病毒和汉城(Seoul)病毒引起的疾病。如本文所用,术语“诊断”指病理学状态的存在或特征的确定,并且在本发明中,诊断用来鉴定恙虫病、钩端螺旋体病和肾综合征出血热。如本文所用,术语“样品”指被怀疑感染了恙虫病、钩端螺旋体病和肾综合征出血热的哺乳动物——包括人——的血液、血清和血浆。图1示出了本发明的实施方案的多诊断试剂盒,图2示出了本发明的实施方案的多诊断试剂盒的试纸条。参照图1和2,多诊断试剂盒10可包括试纸条100,试纸条100可包括第一试纸条100a和第二试纸条100b。第一试纸条100a和第二试纸条100b可检测来自样品的恙虫抗体、钩端螺旋体抗体和肾综合征出血热抗体。第一试纸条100a可检测恙虫IgM抗体、钩端螺旋体IgM抗体和肾综合征出血热IgM抗体,第二试纸条100b可检测恙虫IgG抗体、钩端螺旋体IgG抗体和肾综合征出血热IgG抗体。第一试纸条100a和第二试纸条100b中的每一个可包括支撑件110、反应膜120、样品垫130、金标垫(goldconjugatepad)140、预反应线150、反应线160、对照线170、以及吸收垫180。支撑件110是试纸条100的基层,且在支撑件110上可设置反应膜120、样品垫130、金标垫140和吸收垫180。反应膜120可为硝酸纤维素膜。在反应膜120上可设置预反应线150、反应线160和对照线170。预反应线150、反应线160和对照线170可以以2.0至4.5mm的间隔设置。样品垫130可吸收经由样品注入口200注入的样品。第一试纸条100a的样品垫130可通过以下步骤制造:浸入含有50mMTris(pH8.0)、1%吐温20、0.5MNaCl和0.1%NaN3的溶液中,然后干燥。第二试纸条100b的样品垫130可通过以下步骤制造:浸入含有50mMTris(pH8.0)、1%吐温20、0.2%BSA和0.1%NaN3的溶液,然后干燥。金标垫140可被设置成与样品垫130重叠。被吸收到样品垫130的样品可通过毛细作用被移动到金标垫140中。金标垫140可包含标志抗体(markerantibody)。所述标志抗体可包含金标抗人IgM、金标抗人IgG和金标鸡IgY。所包含的金标抗人IgM的浓度可为OD1至3,所包含的金标抗人IgG的浓度可为OD2至4,所包含的金标鸡IgY的浓度可为OD0.1至1。第一试纸条100a可包含金标抗人IgM和金标鸡IgY,第二试纸条100b可包含金标抗人IgG和金标鸡IgY。所述标志抗体可与所述恙虫抗体、钩端螺旋体抗体以及肾综合征出血热抗体结合,由此形成复合物。金标垫140可被设置成与反应膜120重叠,由此可使所述复合物向反应膜120移动。可使未与所述恙虫抗体、钩端螺旋体抗体以及肾综合征出血热抗体结合的剩余抗体向反应膜120移动。所述标志抗体可包含有色颗粒。所述有色颗粒可为胶体金颗粒、有色玻璃或塑料珠。反应线160可包括第一反应线161、第二反应线162和第三反应线163。第一反应线161可包含钩端螺旋体抗原。所述钩端螺旋体抗原可包含源自钩端螺旋体的脂多糖的核心多糖和O-特异侧链。所包含的钩端螺旋体抗原的浓度可为2至4mg/ml。在样品包含钩端螺旋体抗体的情况下,所述钩端螺旋体抗体可与金标垫140中的标志抗体结合,由此形成复合物。当所述复合物经过第一反应线161时,所述钩端螺旋体抗体可与第一反应线161的钩端螺旋体抗原结合。这种结合使得所述标志抗体的有色颗粒能够在第一反应线161中沉淀析出,从而形成紫红色条带。第二反应线162可包含恙虫抗原蛋白。所述恙虫抗原蛋白可包含以5∶3的体积比混合的恙虫病东方体Gilliam、Karp和Kato的56kDa基因重组蛋白和恙虫病东方体Kangwon的56kDa蛋白。所包含的恙虫抗原蛋白的浓度可为0.4至0.8mg/ml。在样品包含恙虫抗体的情况下,所述恙虫抗体可与金标垫140中的标志抗体结合,由此形成复合物。当所述复合物经过第二反应线162时,所述恙虫抗体可与第二反应线162的恙虫抗原蛋白结合。这种结合使得所述标志抗体的有色颗粒能够在第二反应线162中沉淀析出,从而形成紫红色条带。第三反应线163可包含肾综合征出血热抗原蛋白。所述肾综合征出血热抗原蛋白可包含源自Soochong病毒的具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的完整的核壳体蛋白(CNP)或源自Soochong病毒的具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的截短的核壳体蛋白(TNP)。所包含的肾综合征出血热抗原蛋白的浓度可为0.1至1.0mg/ml。在样品包含肾综合征出血热抗体的情况下,所述肾综合征出血热抗体可与金标垫140中的标志抗体结合,由此形成复合物。当所述复合物经过第三反应线163时,所述肾综合征出血热抗体可与第三反应线163的肾综合征出血热抗原蛋白结合。这种结合使得所述标志抗体的有色颗粒在第三反应线163中沉淀析出,从而形成紫红色条带。可使未与所述恙虫抗体、钩端螺旋体抗体以及肾综合征出血热抗体结合的剩余标志抗体通过反应线160向对照线170移动。预反应线150可包括第一预反应线151和第二预反应线152。第一预反应线151可包含大肠杆菌(E.coli)提取物。所述大肠杆菌提取物可与第一非特异性抗体结合。所述第一非特异性抗体可为与源自大肠杆菌的蛋白结合的抗体。第一预反应线151可排除以下情况:尽管实际上不存在针对恙虫抗原蛋白的抗体,但由于上述非特异性抗体与包含在恙虫抗原蛋白中的源自大肠杆菌的蛋白的结合,所述抗体实际上不存在但却被误判为存在。第二预反应线152可包含昆虫细胞Sf(草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda))提取物。所述昆虫细胞Sf提取物可与第二非特异性抗体结合。所述第二非特异性抗体可为与源自昆虫细胞Sf的蛋白结合的抗体。第二预反应线152可排除以下情况:由于上述非特异性抗体与包含在肾综合征出血热抗原蛋白中的源自昆虫细胞Sr21的蛋白的结合,针对肾综合征出血热抗原蛋白的抗体实际上不存在但却被误判为存在。对照线170可包含对照蛋白。所述对照蛋白可与所述标志抗体结合。这种结合使得所述标志抗体的有色颗粒能够在对照线170中沉淀析出,从而形成紫红色条带。所述对照蛋白可为选自山羊抗鸡IgY多克隆抗体(山羊抗鸡IgY)、兔抗山羊IgG多克隆抗体和兔抗山羊IgM多克隆抗体的至少一种。所包含的对照蛋白的浓度可为0.1至2mg/ml。吸收垫180可吸收沿着反应膜120移动的剩余样品。吸收垫180可被设置成与反应膜120重叠。针对恙虫抗原蛋白的实施例实施例1.抗原蛋白的表达和分离1.1.嵌合重组56kDa(cr56)蛋白的表达恙虫病东方体以与韩国专利申请公布第2002-0020281号中公开的实施例的五分时时彩方法相同的方式表达、分离和纯化包含恙虫病东方体Gilliam、Karp和Kato的主要表位的嵌合重组蛋白(cr56)。具体而言,将恙虫病东方体Gilliam、Karp和Kato株在小鼠L-929细胞中培养,收集,然后纯化。将纯化的株用酶消化,随后通过苯酚提取和乙醇沉淀进行DNA纯化。基于恙虫病东方体的56kDa蛋白基因的碱基顺序,在Gilliam、Karp和Kato血清型中选择具有30%或更高氨基酸序列同源性的蛋白位点,并且针对Gilliam、Karp和Kato株的各株制备一对寡核苷酸引物。使用所提取的恙虫病东方体的DNA作为模板,采用各引物对进行PCR,以扩增Gilliam、Karp和Kato株的DNA片段。将PCR产物纯化并克隆,以连接在pTYB12载体的相应限制酶消化位点。首先,将Gilliam株的DNA片段引入到pTYB12载体中以制备载体pTG3,并将Karp株的DNA片段引入到pTG3载体中以制备载体pTGP1。将Kato株的DNA片段引入到pTGP1载体中以制备载体pTGPT2。进一步将与Gilliam、Karp和Kato株的DNA片段串联的连接体从pTGPT2载体上切下,并将所述连接体引入pET22b(+)载体中以制备载体pETb7。采用所制备的表达载体转化大肠杆菌,然后培养所述经转化的大肠杆菌以诱导融合蛋白的表达。使用电泳和蛋白质印迹法鉴定所述融合蛋白,之后分离并纯化所表达的融合蛋白抗原。1-2.重组Kangwon56kDa蛋白(kr56)的表达考虑到株系被分为全球原型株Karp、Gilliam和Kato以及Yonchon(与Kangwon最相似),基于种系发生分析(phylogenicanalysis)的结果(FEMAMicrobiologyLetters,1999,180:163-169),上述四种株系被认为最适合用作抗原。Karp、Gilliam和Kato由cr56表示。同样,Yonchon被表示为Kangwon的kr56,Kangwon与Yonchon相似。本发明人使用Kangwon56kDa重组蛋白(kr56)作为嵌合重组蛋白(cr56)的辅助抗原。(1)Kangwon56kDa蛋白(kr56)表达的概述对被称为Kangwon87-61的主要抗原结构域的84(250bp)至445(1335bp)长的一部分氨基酸序列进行修饰以包含NcoI和SalI识别位点,制备一对引物并进行PCR。采用限制酶NcoI和SalI对PCR产物和表达载体pET30a进行消化,然后将它们彼此连接。使用所得到的质粒转化大肠杆菌BL21,然后从所述大肠杆菌BL21中提取蛋白。上述引物示于下表1。[表1]*质粒pET30a表达His-标记的融合蛋白。(2)基因克隆与表达将通过聚合酶链反应扩增的DNA(84(250bp)至445(1335bp)的362个氨基酸(共1086bp))在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳,然后使用QIAGEN凝胶洗脱试剂盒(QIAGENInc.,美国)回收。将经扩增以适合于所需大小的DNA条带在紫外透射仪上切下,转移至微量管,以相当于琼脂糖凝胶体积3倍的量加入NaI溶液,并在60℃下静置5分钟,以便凝胶完全溶解。进一步向凝胶溶液中加入玻璃乳(glassmilk),搅拌10秒钟,并在室温下在17000g(Hanil,AI.5S-24,12000rpm)下离心1分钟,随后除去上清液。使微量管在室温下静置5分钟,然后干燥。向其中加入洗脱缓冲液,之后搅拌微量管,然后在17000g(12000rpm)下离心,并将上清液转移至新的微量管。将纯化的PCR产物和pET30a载体用限制酶NcoI和SalI完全消化,然后使用Geneclean试剂盒II通过相同的五分时时彩方法回收。将100ng经限制酶酶切的载体和100ng经限制酶酶切的PCR产物互相混合,与10×连接酶缓冲液(250mMTris-HClpH7.8、100mMMgCl2、20mMDTT和4mMATP)和连接酶结合,并在4℃下反应18小时。(3)感受态细胞的制备与转化将在LB培养基中培养了18小时的大肠杆茵BL21细胞用LB培养基稀释100倍,然后再培养至在600nm处的吸光度达到0.3。使细胞在冰中静置30分钟,之后轻轻倒出培养基上清液,并以等于培养基体积一半的量加入0.1MCaCl2,以悬浮大肠杆菌细胞。将悬浮的大肠杆菌细胞在冰中静置1小时,在2000g(4100rpm)下离心10分钟,然后悬浮于为培养基体积十分之一的0.1MCaCl2中,然后用于转化。(4)转化将上述(3)中制备的感受态细胞与连接产物混合,置于冰中,然后在42℃下热激1分30秒。向所得混合物中加入LB培养基,并在37℃下培养1小时。将肉汤接种到LB琼脂平板培养基中,然后在37℃下培养。(5)从转化的大肠杆茵中分离质粒DNA将转化的大肠杆茵的单个茵落接种到含有卡那霉素的LB培养基中,然后在37℃下震荡培养。使用AccuPrep质粒提取试剂盒(AccuPrepPlasmidExtractionkit)进行质粒DNA的提取。将肉汤在室温下在750g(2500rpm)下离心10分钟,由此仅回收细胞粒状沉淀,然后向所述细胞粒状沉淀中加入再悬浮缓冲液,搅拌,加入裂解缓冲液,然后在室温下静置5分钟。向所得产物中加入中和缓冲液,在室温下静置,然后在17000×g(12000rpm)下离心,之后将上清液转移到结合柱管中,然后在室温下在17000×g(12000rpm)下离心,以除去经提取的溶液。随后,进行80%乙醇等分(aliquoting)和离心,之后仅将结合柱放置在新试管中。向结合柱中加入洗脱缓冲液,使其在室温下静置,并离心,然后将上清液转移至新微量管中。(6)蛋白表达和分离将当前的培养基在37℃下采用种子培养五分时时彩方法的肉汤进行接种,在220rpm下搅拌1小时45分钟,当OD为0.5至0.6时采用0.5mMIPTG进行接种,并培养3小时。其后,在4℃下在3000rpm下离心30分钟,向粒状沉淀中加入1×结合缓冲液(6M尿素、500mMNaCl、20mMTris-HCl(pH8.0)、5mM咪唑),并使用超声波仪将细胞破碎(脉冲:10秒开,20秒关,时间:6分钟×2次(在此期间进行一次换向),Amp.:45%)。其后,将kr56在4℃下在14000rpm(高压灭菌的超速离心机瓶中的转子7)下离心15分钟,之后,将上清液冷冻,并将粒状沉淀再悬浮于1×结合缓冲液(50ml,基于1L锥形瓶中的肉汤计)。将粒状沉淀在冰中放置1小时(静置30分钟,然后倒置),在4℃下在14000rpm(高压灭菌的超速离心机瓶中的转子7)下离心30分钟,从而得到上清液。将上清液用1×结合缓冲液(6M尿素)稀释2倍,过滤(0.45nm注射过滤器)并在4℃下储存。(7)蛋白纯化采用2mlHisbind树脂(Novagen)填充柱,然后使用蒸馏水、1×载样缓冲液(chargebuffer)和1×结合缓冲液进行准备。使抗原蛋白穿过所述柱以后,采用1×洗涤缓冲液洗涤所述柱。使1×洗脱缓冲液(6M尿素、500mMNaCl、20mMTris-HCl(pH8.0)、500mM咪唑)穿过所述柱,回收1ml的每种蛋白。采用AmiconUltra30K进行浓缩后,使用BCA蛋白测定确定各级分中蛋白的浓度。对于包含在实施例1的恙虫抗原蛋白中的恙虫病东方体Kangwon的56kDa蛋白的具体氨基酸序列,可参见韩国专利第10-0796772号中公开的氨基酸序列。实施例2.依赖抗原浓度的试剂盒的反应(以确定假阳性)以0.6mg/ml、0.9mg/ml、1.2mg/ml和1.5mg/ml的浓度制备实施例1的恙虫抗原蛋白。制备四个包含相应浓度的恙虫抗原蛋白的试剂盒。使用免疫荧光抗体试验(其为一种诊断恙虫病的标准试验五分时时彩方法)评价患者的样品,之后制备一个阴性血清(DK13)和三个阳性血清(90-202、00-350、89-129),将它们加到具有不同抗原浓度的各诊断试剂盒以观察反应。图3示出了本发明的实施方案的依赖恙虫抗原蛋白浓度的试剂盒反应。依赖恙虫抗原蛋白浓度的试剂盒反应在下表2中给出。[表2]从表2和图3中可明显看出,其中恙虫抗原蛋白的浓度为0.9mg/ml、1.2mg/ml和1.5mg/ml的诊断试剂盒是假阳性,而其中恙虫抗原蛋白的浓度为0.6mg/ml的诊断试剂盒不是假阳性。实施例3.依赖混合抗原组成的试剂盒反应以0.6mg/ml制备实施例1的恙虫抗原蛋白,并以相同的浓度制备常规恙虫抗原蛋白。常规恙虫抗原蛋白由cr56、kr56和r21蛋白组成,所述cr56、kr56和r21蛋白以5∶2∶1的比例混合。制造包含实施例1的恙虫抗原蛋白的诊断试剂盒以及包含常规恙虫抗原蛋白的诊断试剂盒,并测量其对于阴性和阳性血清的反应性。作为对照组,通过IFA测量了阴性和阳性血清的Ab效价。图4示出了本发明的实施方案的依赖恙虫抗原蛋白组成的试剂盒反应。常规恙虫抗原蛋白和实施例1的恙虫抗原蛋白的抗体应答的灵敏度结果由-=0、+=1、++=2、+++=3、++++=4表示,如下表3所示。[表3]从表3和图4中可明显看出,当恙虫抗原蛋白不合有r21并且kr56的量增加时,抗体应答的灵敏度升高。针对钩端螺旋体抗原的实施例实施例4.钩端螺旋体抗原4-1.钩端螺旋体株的培养将EMJH(钩端螺旋体培养基基底EllinghausenMcCulloughJohnsonHarris)以0.23g/90ml溶解并消毒,然后加入10ml富含钩端螺旋体的EMJH以制备培养基。将该培养基用钩端螺旋体接种并在30℃下震荡培养5天。4-2.钩端螺旋体抗原的制备将在EMJH培养基中培养了5天的钩端螺旋体在4000×g下离心20分钟,采用1×PBS缓冲液(137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4和2mMKH2PO4)洗涤三次,然后在100℃下加热1小时。使其与150μg/ml蛋白酶K在37℃下反应16小时,加入2mMEGTA,使其在70℃下反应15分钟,然后在4℃下在180000×g下离心2小时。将所得粒状沉淀悬浮于H2O中,以得到脂多糖(Westpha和Jann,1965)。将如此纯化的LPS抗原用1%乙酸处理,在100℃下加热1小时,并在3000×g下离心20分钟,将沉淀析出的脂质A除去,得到多糖抗原。使用标准多糖测量如此获得的抗原的量,所述标准多糖是通过以与上述相同的方式处理从大肠杆菌(Escherichiacoli)中纯化的LPS(Sigma)而得到的。实施例5.钩端螺旋体多糖的抗原性评价5-1.蛋白质印迹法使用Bio-RadProteanII电泳装置在厚度为1mm或1.5mm的12%凝胶上进行SDS-PAGE。使用Bio-Rad转印槽(Transblotcell)在80V下在30分钟内将蛋白从电泳后的凝胶中转移到膜上。将转移后的膜用含有5%脱脂乳和0.1%吐温20的1×TBS缓冲液封闭,一抗为兔免疫血清(问号钩端螺旋体(L.interrogans)株WH-19),二抗为稀释至1∶10000的辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG(Bio-Rad)。免疫反应完成后,使用ECL试剂盒(AmershamPharmaciaBiotech)进行显色。图5示出了纯化的多糖的抗原性,其是根据本发明的实施方案从patoc型和lai型中分离的多糖的SDS-PAGE(A)和蛋白质印迹法(B)的结果。如图5所示,问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)血清变lai型的多糖在SDS-PAGE凝胶电泳图方面与问号钩端螺旋体血清变型patoc型株Patoc的多糖相似,并且14kDa或更大的多糖存在于lai型和patoc型二者中并被认为充当抗原。5-2.斑点印迹法将1μg(1μg/1μl)抗原滴加到硝酸纤维素膜上,然后在37℃下干燥1小时。将干燥后的膜用5%脱脂乳-TBST封闭1小时,使其与作为一抗的患者血清(稀释至1∶3000)反应1小时,并与作为二抗的辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG(稀释至1∶10000)反应。反应完成后,使用ECL试剂盒进行显色,并将其结果与MAT结果进行比较。在大多数患者血清中,观察到阳性信号。下表4示出了MAT和斑点印迹法的比较结果。[表4]5-3.酶联免疫吸附测定(ELISA)在Engvall和Perlmann(1972)的五分时时彩方法的基础上进行多糖ELISA。将聚-L-赖氨酸(10μg/ml)用0.01MPBS稀释以预处理板,并使其在室温下反应24小时。将所述板用含有0.05%吐温20的PBS缓冲液洗涤两次,之后将多糖悬浮于PBS中用100μl/孔处理所述板。使经处理的板在37℃下反应1小时,采用含有0.05%吐温20的PBS缓冲液洗涤三次,采用山羊血清处理,并在37℃下进行封闭。使用20名钩端螺旋体病患者的血清和20名正常人的血清作为一抗,并使用辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG(Bio-Rad)(稀释至1∶10000)作为二抗。每个孔用底物处理以由此观察其显色,使用酶标仪在490nm处测量吸光度。结果,发现钩端螺旋体鞭毛(Leptospiraflagella)重组蛋白表现出72%至88%的灵敏度和88%至90%的特异性,而本发明的多糖呈现出95%的灵敏度和95%的特异性。因此,作为用于钩端螺旋体病早期诊断的抗原候选物,发现所述多糖优于所述蛋白。使用ELISA对所述多糖的灵敏度和特异性进行测量的结果示于下表5。[表5]a:通过MAT诊断的患者血清数:20b:正常血清数:20针对肾综合征出血热抗原蛋白的实施例实施例6.Soochong病毒和培养细胞将从韩国的大林姬鼠(Apodemuspeninsulae)中分离的Soochong病毒株SooV-2在vero细胞中传代培养。为了vero细胞的增殖和维持,在37℃的培养箱中使用含有10%胎牛血清(PBS)的EMEM(Eagle最低基础培养基)在5%CO2存在下进行培养,当培养至约90%的单层时使用细胞。实施例7:病毒RNA的分离将Soochong病毒在其中增殖的细胞在1075g(3000rpm)下离心3分钟,加入750μlTrizolLS(Gibco)溶液,使其在室温下静置5分钟,加入200μl氯仿,然后再在室温下静置10分钟。在4℃下在17000g(12000rpm)下离心15分钟,之后除去沉淀析出的粒状沉淀,向上清液中加入相同体积的异丙醇,使其在室温下静置10分钟,在4℃下在17000g(12000rpm)下离心15分钟,从而使RNA沉淀析出,之后将所得到的RNA粒状沉淀用75%乙醇洗涤一次,在空气中干燥10分钟,然后溶解于DEPC水溶液中。实施8:cDNA的合成与PCR图6示出了本发明的实施方案的核壳体蛋白(NP)、完整的NP(CNP)和截短的NP(CNP)在Soochong病毒的S区段的基因结构,图7示出了本发明的实施方案在PCR之后的TNP的DNA条带(约370bp)和CNP的DNA条带(约1300bp)。用于制备Soochong病毒重组抗原的PCR引物示于下表6中。[表6]从图6和表6中可明显看出,为了从编码NP的核酸序列(GenBank登记号AY675350)SEQIDNO:1合成cDNA,向4μl实施例7的RNA溶液中加入1μl表6中的各引物(10pmol)并加入包含5×逆转录酶缓冲液、10mMdNTPs、100pmol/μlOligo(dT)、40单位/μlRNA酶抑制剂(RNasin)和200单位/μlMMLV逆转录酶的混合物。反应在30℃下进行10分钟,在45℃下进行30分钟,在99℃下进行5分钟并在5℃下进行5分钟,得到cDNA。包含5μlcDNA产物、10pmol引物对、10mMdNTPs、10×taq缓冲液和5单位/μlTaq聚合酶的混合物的PCR以如下的循环进行一次:95℃5分钟、52℃2分钟和72℃2分钟;以如下的循环进行五次:95℃1分钟、52℃1分钟和72℃1分钟;以如下的循环进行20次:95℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟;并以如下的循环进行一次:95℃1分钟、60℃1分钟和72℃7分钟,从而扩增DNA。将扩增的DNa在-20℃下保存。图7示出了PCR之后的TNP的DNA条带(约370bp)和CNP的DNA条带(约1300bp)。如图7所示,使用各引物进行PCR,由此在约370bp处鉴定TNP的DNA条带,并在约1300bp处鉴定CNP的DNA条带。实施9.扩增产物的克隆图8示出了本发明的实施方案的将TNP的DNA和CNP的DNA克隆到pGem-T-EasyPCR克隆载体中。如图8所示,将通过PCR扩增的在约370bp和约1300bp处的DNA在琼脂糖凝胶上进行电洗脱并克隆到pGem-TEasyPCR克隆载体(Invitrogen)中。通过采用限制酶BglII和HindIII的消化来鉴定TNP和CNP的DNA。这旨在制备CNP(1287bp:37-1323)和TNP(357bp:37-393)多肽。其氨基酸序列示于SEQIDNO:2和3中。将其中插入了含TNP的369bp的质粒称为pGT-SooV2-TNP,将其中插入了含CNP的1299bp的质粒称为pGT-SooV2-CNP。实施例10.克隆到表达载体中图9示出了本发明的实施方案的将pGT-SooV2-TNP和pGT-SooV2-CNP的PCR产物克隆到在N-末端具有His-Taq的杆状病毒质粒载体中。如图9所示,将在N-末端具有His-Taq的表达融合载体,即pBlue-Bac-His2B(Invitrogen),采用限制酶BglII和HindIII处理,并将pGT-SooV2-TNP和pGT-SooV2-CNP的PCR产物采用限制酶BglII和HindIII进行克隆,从而得到pBac-SooV2-TNP和pBac-SooV2-CNP。实施例11.重组杆状病毒的形成图10示出了本发明的实施方案的使用杆状病毒表达载体系统从pBac-SooV2-TNP和pBac-SooV2-CNP形成Bac-SooV2-TNP和Bac-SooV2-CNP。如图10所示,使用Bac-N-Blue杆状病毒表达载体系统将pBac-SooV2-TNP和pBac-SooV2-CNP制成Bac-SooV2-TNP和Bac-SooV2-CNP。将对数期的Sf9细胞(2×106)置于60mm的平皿中以形成单层。为了制备转染混合物,将10μl(0.5μg)Bac-N-BlueTMDNA置于微量离心机中,并加入以下溶液。pBac-SooV2-TNP或pBac-SooV2-CNP(1μg/μl):4μlGrace昆虫培养基(没有补充剂或FBS):1mlCellfectin试剂(在使用前混合均匀并在使用过程中不断混合):20μl使平皿在室温下静置15分钟,从平皿中除去培养基,之后加入2ml既不合有补充剂也不合有FBS的Grace昆虫培养基,从单层中再次除去培养基,并将所制备的转染混合物滴加到60mm的平皿中。使该平皿在室温下静置约4小时,加入1mlTNM-FH培养基,密封,并在27℃下孵育72小时。当以这种方式进行共转染时,将复制的重组杆状病毒用作病毒原种(stock)。实施例12.重组杆状病毒的纯化使用终点稀释法测量所述病毒原种的浓度。对于确定病毒效价的终点稀释,对病毒接种溶液进行10-5至10-8倍的连续稀释,将各稀释溶液接种到以1×104/孔的细胞浓度等分到96孔板上的培养细胞中,并在27℃下进行连续培养。从感染了病毒的孔与未感染病毒的孔的比例计算病毒效价,以确定PFU(噬斑形成单位)。为了选择纯的病毒,将病毒接种溶液稀释10-2至10-8倍,将各稀释溶液接种到以1×104/孔的细胞浓度等分到96孔板上的培养细胞中,并在27℃下进行连续培养。从接种后第四天起,使用显微镜观察到细胞内多面体晶体的形成以及病毒感染,选择最大稀释因子的孔中的病毒,并以相同的方式纯化至少三次,最终得到纯的病毒。实施例13.重组蛋白的表达和分离将Sf9昆虫细胞以约5×106的密度播种在75cm2烧瓶中,并用5MOI重组病毒接种。在感染后第五天,观察到包含体的形成并回收所有细胞。将回收的细胞在6000g(7000rpm)下离心,并收集粒状沉淀,悬浮于1×结合缓冲液(5mM咪唑、20mMTris-HClpH7.9、0.5MNaCl)中,并使用超声波仪在18Hz下搅拌六次,每次15秒。在23400g(14000rpm)下离心15分钟,并以可溶形式保存上清液。同样,将不溶形式的粒状沉淀悬浮于含有6M尿素的1×结合缓冲液中,使其在4℃下静置1小时,并在23400g(14000rpm)下离心30分钟以回收上清液(裂解的粒状沉淀)。将经回收的裂解的粒状沉淀通过His-结合色谱法纯化以得到纯化的粒状沉淀。使所述可溶形式,裂解的粒状沉淀和纯化的粒状沉淀进行SDS-PAGE,并通过蛋白质印迹法鉴定其中存在所述重组蛋白的任何级分。作为对照,使用野生型病毒感染的细胞的可溶形式。对于蛋白质印迹法,使用患有肾综合征出血热(HFRS)的患者的血清和正常血清作为一抗。图11示出了本发明的实施方案的使用患者血清和正常血清来检测TNP的蛋白质印迹法的结果,其中下部箭头处的条带被指认为TNP的部分降解。左边的图像示出了使用患有肾综合征出血热的患者的血清作为一抗的结果,右边的图像示出了使用正常血清作为一抗的结果(第1道:感染了野生型杆状病毒的细胞的溶液形式,第2道:感染了重组杆状病毒的细胞的可溶形式,第3道:采用含有尿素的缓冲液处理细胞的不溶形式然后离心后的裂解的粒状沉淀,第4道:3的纯化的粒状沉淀)。如图11所示,对于TNP,该蛋白以可溶形式存在的量比以不溶形式存在的量更大。除了在22kDa处的特异条带——其对应TNP级分——之外,基于患者血清的蛋白质印迹法的结果,可以看出即使在纯化的粒状沉淀以及可溶形式中,本应显示为弱的下部条带是强的,因此认为这是由特异性反应引起的。对于正常血清,两个条带均未出现。下部条带被认为是由TNP的部分降解造成的。图12示出了本发明的实施方案的TNP和CNP的纯化的粒状沉淀的蛋白质印迹法的结果(第1道:未感染病毒的细胞,第2道:感染了杆状病毒的细胞,第3道:感染了CNP克隆的重组杆状病毒的细胞,第4道:感染了TNP克隆的重组杆状病毒的细胞,第5道:感染了CNP克隆的重组杆状病毒的细胞,第6道:感染了TNP克隆的重组杆状病毒的细胞)。如图12所示,仅在患有肾综合征出血热(HFRS)的患者中观察到CNP,并证实产生了约50kDa的重组蛋白。实施例14:通过His-结合亲和色谱法的重组蛋白的纯化采用2mlHis-结合树脂(Novagen)填充柱,并使用蒸馏水、1×载样缓冲液和1×结合缓冲液进行准备。使抗原蛋白穿过所述柱,采用1×结合缓冲液(5mM咪唑、20mMTris-HClpH7.9、0.5MNaCl)和1×洗涤缓冲液(40mM咪唑、20mMTris-HClpH7.9、0.5MNaCl)洗涤所述柱。使洗脱缓冲液(300mM咪唑、0.5MNaCl、20mMTris-ClpH7.9)穿过所述柱以回收1ml的每种蛋白。通过Lowry测定法确定各级分中蛋白的浓度。进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法以鉴定蛋白。实施例15.重组蛋白测定法15-1.蛋白质印迹法在厚度为1mm或1.5mm的10%凝胶上对10μg纯化的重组蛋白/孔进行电泳。使用Bio-Rad运送器在80V下在40分钟内转移电泳后的凝胶。将转移后的膜用5%脱脂乳-TBST(Tris缓冲的盐水-吐温20)封闭1小时,使其与作为一抗的患者血清(稀释至1∶3000)反应1小时,并与作为二抗的辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG(稀释至1∶10000)反应。反应完成后,使用ECL试剂盒进行显色。基于蛋白质印迹法的结果,重组CNP和TNP只在患有肾综合征出血热的患者的血清中分别在约50kDa和22kDa处反应,但不与正常血清反应。15-2.斑点印迹法将1μg重组蛋白滴加到硝酸纤维素膜上并在37℃下干燥1小时。将干燥后的膜用5%脱脂乳-TBST封闭1小时,使其与作为一抗的患者血清和正常血清(稀释至1∶3000)反应1小时,并与作为二抗的辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG(稀释至1∶10000)反应。反应完成后,使用ECL试剂盒进行显色。使用感染了汉他病毒或汉城病毒的患有肾综合征出血热(HFRS)的患者的血清进行斑点印迹法。如下表7所示,在CNP中显示的阳性信号比在TNP中显示的更强,并且与正常血清没有发生反应。[表7]a:数据以强阳性(+++)、中阳性(++)或弱阳性(+)斑点印迹法结果的形式表示。*十份正常血清不与重组NP抗原反应。15-3.ELISA将重组蛋白抗原用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)在1μg/ml下进行稀释,加入96孔微量板中,然后使其在4℃反应18小时。采用含有0.05%吐温20的PBST洗涤两次,并采用3%BSA在37℃下封闭2小时。使用稀释形式的感染汉他病毒、汉城病毒、Pummala病毒或ProspectHill病毒的大鼠的血清作为一抗,二抗为稀释至1∶6000的辣根缀合物抗大鼠IgG(IgM)。使用底物溶液进行显色,使用酶标仪在490nm的波长下测量OD。从下表8中可明显看到,重组抗原CNP与汉他病毒和汉城病毒反应但不与Pummala病毒或ProspectHill病毒反应。[表8]针对以下病毒的大鼠抗血清汉他汉城PummalaProspectHill通过ELISA测定的CNP的反应性++++++--尽管为了说明的目的公开了本发明的优选的实施方案,但是本领域技术人员将理解,在不背离所附权利要求书中公开的本发明的范围和精神的情况下,可以从所述实施方案中做出各种修改和其他等同的实施方案。所公开的实施方案应被认为是示例性的而非限制性的。本发明的范围并非示于上述说明书中而是示于权利要求书中,在与其等同的范围内的所有变异应理解为并入本发明。当前第1页1 2 3 
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